新手做ELISA實驗：大家來圍觀解答

本期新聞中心應客戶要求，讓我們一起來圍觀回答新手做試驗遇到的問題回答：
以下由客戶自訴：
1.選用的是ELISA雙抗體夾心法測定尿液標本中人腎損害分子-1（Kim-1）水平。某一國產96孔ELISA試劑盒（本次試驗只用了48孔，猜想應該不是試劑盒的原因，由于好幾個師姐用的都是這家的試劑盒，成果還能夠，能做出規范曲線，且復孔間差異并不大）。
2.一次加樣時刻：闡明書上要求一次加樣時刻控制在5分鐘內，而我的一次加樣時刻根本在10min以上。
試驗前預備：
1.尿液樣本的搜集與保存：-80℃冰箱保存尿液標本1年左右，1周前在冰中消融分裝，3000轉離心30min取上清液（因離心管與離心機不匹配，故將尿液從原離心管吸至相匹配的離心管中，原離心管下邊有尿沉渣，吸的時分未打勻而是直接吸的，不知道是否對成果有影響？），需要用的放在4度冰箱（做試驗用的標本也就是放在4度冰箱約1周的標本），暫時不需要用的放在-20度冰箱。
2.試劑盒從4度冰箱取出，將需要用的試劑及板拿出來放在試驗臺平衡45min。
3.尿液試驗前未做稀釋處理。
操作步驟：
1.規范品的稀釋與加樣：依照闡明書，我選用的筆直加樣，只是加樣速度慢，盡量加至底部，不觸壁，不產生氣泡。
2.溫育闡明書上要求30min，而我的大概是35min，是在培養箱中進行的。
3.洗刷：也是加樣速度慢，悉數加樣后停了1min，甩干（甩到甩不出液體停止），然后在濾紙上拍干（拍到沒有液體流出停止），就這樣重復了5次。
4.顯色：剛開始培養箱溫度沒升至37度，我也先放里邊了，是等升至37度后開始計時的。
疑問：
1.為什么規范孔的濃度會呈現如上圖的成果？
2.為什么復孔間的差異這么這么的大？
試驗中沒有少加或加錯樣，懇請各位戰友幫助找原因，不勝感激！
1.為什么規范孔的濃度會呈現如上圖的成果？  

你規范品也就120-80ng/L有些線性，可使后邊的40-10ng/L OD值又再次俄然高上去了，且40-10ng/L的OD值復孔間偏差還算不大。我覺得你先從稀釋的視點看看吧，闡明書供給的稀釋辦法太費事，可能會導致操作時呈現問題，你不如在潔凈的EP管中依照規范品的比例關系進行稀釋，稀釋完后再一致參加酶標板孔中。
2.為什么復孔間的差異這么這么的大？ 我覺得兩方面原因，你規范品復孔差異大，可能跟稀釋方法有關。你的樣本OD值3復孔間有時會呈現偏差較大的狀況 可能跟洗板有關系，用洗板機洗板洗，可能與你尿樣未混勻也有關（雖然可能性很小）。可是我覺得和你說的：“故將尿液從原離心管吸至相匹配的離心管中，原離心管下邊有尿沉渣，吸的時分未打勻而是直接吸的”沒有什么關系，究竟你已經離心取上清了。
至于加樣時刻5min仍是10min，溫預30min，仍是35min等等操作上與闡明書略有差異的當地都不是呈現你這種成果的直接原因，究竟雙抗體夾心法的試劑盒對操作和時刻沒有競爭法那么嚴厲。