錢美圓，徐波
應用技術研究中心
近日，三泰科技制備純化實驗室的純化工程師小錢接到某制藥公司委托的樣品制備純化任務，需要對某極性很大且難溶于水的樣品進行制備純化。基于樣品的性質，小錢首先想到了正相分離模式，但是經過小量樣品的純化預實驗后，小錢發現樣品在正相分離柱上保留太強以至于很難洗脫下來，看來正相模式是行不通了。
沒關系，還可以嘗試反相分離模式，于是小錢稱取了50 mg樣品，溶于5 mL乙腈/甲醇/水/DMF（V:V:V:V=23:23:2:2）中，超聲加熱使樣品*溶解，然后根據樣品的HPLC分析條件設置好洗脫梯度，并根據實際制備分離過程中的出峰情況實時調整梯度設置，制備純化的實驗條件如表1所示。
表1. 小量樣品制備純化實驗參數設置
圖1. 小量樣品的制備分離圖譜
制備分離圖譜如圖1所示，從預實驗的分離結果來看，目標產物可以與雜質有效的分離，且分離度較高，可以滿足目標物和雜質分別收集的需求。于是，小錢接下來進行了放大實驗，她將1 g樣品溶于50 mL甲醇/乙腈/水/DMF（V:V:V:V=23:23:2:2）中，超聲加熱使樣品*溶解，然后設置好制備純化實驗的參數，如表2所示。
表2. 樣品量放大后的制備純化實驗參數設置
圖2. 樣品量放大后的制備分離圖譜
制備分離圖譜如圖2所示，分析圖譜可知，在上樣量放大20倍后，所用分離柱放大了相應的比例，但由于樣品的溶劑問題使分離結果與預期不符。因DMF在紫外檢測波段有強吸收，會干擾樣品的檢測，因此在配置樣品溶液時使用了高比例的甲醇和乙腈。在此條件下大體積上樣時形成了體積過載，因此大量樣品隨著洗脫溶劑很快就被洗脫出來，未能獲得有效的保留和分離。此外，由于330 g純化柱有效柱床高度相比25 g純化柱沒有成比例的增加，因此前者的柱效相比后者下降較多，這也導致了分離圖譜中目標產物與雜質未能有效分離。小錢在與同事們討論后，決定只好放棄一步到位的想法，利用DMF溶劑溶解少量樣品后，分多次對樣品進行制備純化。
小錢稱取了600 mg樣品，溶于6 mL DMF中，超聲加熱使樣品*溶解后，開始進行樣品分離純化實驗，實驗參數設置如表3所示。
表3. 改進后的放大制備純化實驗參數設置
圖3. 改進后的樣品制備分離圖譜
小錢利用相同的實驗參數設置，對總計6.5 g樣品進行了多次進樣，圖3所示為其中兩次的樣品制備分離圖譜。分析圖譜可知，在減小樣品進樣體積后，樣品得到了有效的分離純化，目標產物和雜質分離度良好，且分離重現性不錯。經HPLC分析，純化后收集的目標產物純度為98.4%，回收率89.4%，雜質純度為88.1%，回收率74.8%，樣品分離前后的HPLC分析圖譜如圖4所示。
圖4. 分離前樣品、分離純化后得到的目標產物及雜質的HPLC分析圖譜
總結這個樣品制備純化案例，在對此類具有很大極性同時又難溶于水的樣品進行分離純化時，可以參考本案例中的思路，即采用少量有機相溶劑對樣品進行溶劑后，分多次進樣，進而完成全部樣品的制備純化。三泰科技出品的SepaBeanTM machine配合SepaFlash系列反相純化柱，可以為用戶提供快速的樣品制備純化解決方案，助力實驗室研究人員輕松完成各類樣品純化任務。
