幾種三聚氰胺快速檢測方法比較
2007年3月,美國發生多起因食用寵物食品而導致寵物中毒死亡事件。2008年9月,中國發生因食用三鹿嬰幼兒奶粉導致嬰幼兒產生腎結石病癥的嚴重事件。兩起事件的原因都是在食品或飼料中非法添加大劑量三聚氰胺。因此,如何快速準確的分析食品和飼料中的三聚氰胺成為食品企業、食品管理機構和廣大消費者密切關注的問題。
為科學合理地篩選快速、簡便、準確、經濟的三聚氰胺檢測方法，中國*提出搭建快速檢測方法測試平臺的建議，并承擔了*應急支撐項目“三聚氰胺快速檢測技術測試平臺的建設"。
該平臺啟動以來，以檢測技術為支撐，以盲樣測試結果為依據，開展技術評價，在國內*“統一現場測試、統一評價方案、統一判別依據、統一專家評審、統一現場公布測試結果"的三聚氰胺檢測方法評價模式。以比對互認為基礎，建立乳與乳制品中的三聚氰胺氣相色譜同位素稀釋質譜法和液相色譜同位素稀釋質譜法，為評價快速檢測方法奠定了重要的技術基礎。
為確保三聚氰胺檢測結果的有效性，全面提高檢測實驗室對原料乳及奶粉中三聚氰胺檢測能力水平，測試平臺先后組織實施了5輪全國三聚氰胺快速檢測技術方法的現場統一測試評價活動，共測試評價了56種檢測技術或方法，有效推出液相色譜法、拉曼光譜法、膠體金試免疫層析法（膠體金速測卡法）、酶聯免疫法(ELISA試劑盒法)4種三聚氰胺快速檢測方法。
本文對常用的三種三聚氰胺快速檢測方法：液相色譜法、酶聯免疫法和膠體金免疫層析法的原理、特點做簡單介紹并對其應用進行比較。
1.液相色譜法
國家標準GB/T22400??2008公布了原料乳中三聚氰胺快速檢測的液相色譜法（HPLC法）,采用乙腈作為原料乳中的蛋白質沉淀劑和三聚氰胺提取劑,0.2um微孔濾膜過濾后供HPLC測定。采用的色譜柱為強陽離子交換色譜柱,流動相為乙腈??緩沖液(10mmol/L檸檬酸,10mmol/L辛烷磺酸鈉,調節pH至3.0),采用紫外/二極管陣列檢測器檢測,定量限為0.3mg/kg,定量靈敏度提高,且分析時間較短。HPLC法雖然應用普遍,但存在一定的局限性,樣品前處理過程復雜,儀器昂貴,對檢測人員的要求高，檢測成本高。
1.1原理
用乙腈作為原料乳中的蛋白質沉淀劑和三聚氰胺提取劑，強陽離子交換色譜柱分離，液相色譜-紫外檢測器/二極管陣列檢測器檢測，外標法定量。
1.2主要試劑和材料
1.2.1乙腈（CH3CN）：色譜純。
1.2.2磷酸（H3PO4）。
1.2.3磷酸二氫鉀（KH2PO4）。
1.2.4三聚氰胺標準物質（C3H6N6）：純度大于或等于99%。
1.2.5三聚氰胺標準貯備溶液：1.00×103mg/L。
1.3.儀器
1.3.1液相色譜儀：配有紫外檢測器/二極管陣列檢測器。
1.3.2分析天平：感量0.0001g和0.01g。
1.3.3pH計：測量精度±0.02
1.4檢驗操作：按國標GB/T22400??2008要求操作。
2.酶聯免疫吸附法(ELISA)
酶聯免疫法(enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA)是在免疫熒光和組織化學基礎上發展起來的新技術。其主要是利用抗原與抗體的高特異性反應，通過合適的載體，使酶標抗原或抗體與待測樣品反應，形成酶標抗原抗體復合物，在相應的酶底物參與下，復合物上的酶催化底物使之水解成有色物質。一定條件下，呈色物質與待測物的含量直接相關，因此可以根據呈色物質顏色的深淺，對待測樣品進行定性定量分析。
近幾十年,國內外已建立了數十種藥物殘留的ELISA分析技術,檢測水平可達ng甚至pg水平。一些發達國家已經研制成商品化的檢測試劑盒用于快速檢測。近十多年來我國也研發出多種商品化的檢測試劑盒用于快速檢測。
酶聯免疫吸附法具有特異性高、靈敏度高、穩定性好、操作簡單、成本低，并可同時對大批量樣品進行快速檢測的特點，目前廣泛應用于食品中獸藥、毒素檢測的初篩中。
08年中國出現“三聚氰胺奶粉事件"時，主要使用的進口三聚氰胺速測試劑盒，現在國內也已研發出商品化的三聚氰胺速測試劑盒，試劑盒靈敏度0.01ppm,zui低檢測限為0.1ppm,已廣泛用于快速檢測。
2.1原理
采用間接競爭ELISA方法，在酶標板微孔條上預包被三聚氰胺抗原，樣本殘留的三聚氰胺和微孔條上預包被的抗原競爭抗三聚氰胺抗體，加入TMB底物顯色，樣本吸光值與其殘留物三聚氰胺成負相關，與標準曲線比較再乘以其對應的稀釋倍數，即可得出樣本中三聚氰胺的含量。
2.2主要試劑、材料
三聚氰胺ELISA檢測試劑盒
2.3儀器
2.3.1獸藥殘留分析儀或酶標儀
2.3.2分析天平：感量0.01g
2.4檢驗操作：按三聚氰胺ELISA檢測試劑盒說明書要求操作。
3.膠體金免疫層析技術
膠體金免疫層析技術（ColloidalGoldImmunochromatographicAssay，GICA)是以膠體金為標記物的免疫層析技術，免疫層析(Immunochromatography,IC)技術是20世紀80年代發展起來的一種將免疫技術和色譜層析技術相結合的快速免疫分析方法。其原理是以條狀纖維層析材料為固相,借助毛細作用使樣品溶液在層析條上泳動,同時,使樣品中的待測物與層析材料上針對待測物的受體(如抗體或抗原)發生高特異、高親和性的免疫反應,層析過程中免疫復合物被富集或截留在層析材料的一定區域(檢測帶),通過酶促顯色反應或直接使用可目測的著色標記物(如膠體金),短時間(5～10min內)便可得到直觀的實驗結果。
膠體金免疫層析技術不需進行結合標記物與游離標記物的分離,省去了繁瑣的加樣、洗滌步驟。因而這種分析技術操作簡單快速,分析結果清楚,易于判斷,且無須儀器。
膠體金免疫層析技術在醫學上應用較多,在食品檢測領域的應用在近幾年才發展起來。國外在此方面起步較早,現在已經有很多成熟的產品問世,國內這幾年也發展較快，有多種應用膠體金免疫層析技術的商業化產品面世，三聚氰胺膠體金速測卡就是其中之一。
三聚氰胺膠體金速測卡檢測靈敏度高，結果直觀，操作方便、快捷，攜帶、儲存方便，成本低，非常適合于基層*部門對三聚氰胺的快速篩查。
3.1原理
三聚氰胺膠體金速測卡的檢測原理是競爭性免疫層析。將著色標記物與待測抗原的特異性抗體(Ab1)相偶聯,沉積在結合區。而檢測區處固相化的是待測抗原或待測抗原的類似物。若樣品中含有待測抗原,則樣品中的抗原和帶有標記物的Ab1形成Ag-Ab1復合物。隨后在通過固相化有待測抗原或其類似物的檢測區時,由于競爭抑制,不再發生反應,檢測線處不顯色;樣品繼續前移,Ag-Ab1復合物被固相化在質控線處的抗Ab1抗體(Ab2)所結合,形成Ab1-Ag-Ab2復合物,使質控線顯色。
3.2主要試劑、材料
三聚氰胺膠體金速測卡
3.3檢驗操作：按三聚氰胺膠體金速測卡說明書要求操作。
4.三種三聚氰胺快速檢測方法的比較
方法 | 液相色譜法 | 酶聯免疫吸附法 | 膠體金免疫層析法 |
儀器 | 液相色譜儀 | 獸藥殘留分析儀/酶標儀 |
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試劑（盒） | 色譜純試劑 | ELISA檢測試劑盒 | 膠體金速測卡 |
| 定性、定量 | 定性、定量 | 定性、半定量 |
檢測靈敏度 | 0.05ppm | 0.1ppm | 0.1ppm |
樣品前處理 | 復雜 | 較復雜 | 簡單 |
檢測操作方法 | 復雜 | 較復雜 | 簡單 |
單個樣品檢測時間 | 30-50分鐘 | 1-1.5小時 | 3-5分鐘 |
批量檢測時單個樣品平均時間
| 15-25分鐘 | 10-20分鐘 | 1-3分鐘 |
儀器市場價 | 大于40萬元 | 4-7萬元 |
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耗材市場價 | 50-200元/個 | 2500元/96孔 | 20元/條 |
適合場所 | 實驗室 | 實驗室、檢測車 | 基層*單位、企業 |
