科研實驗中血標本提取RNA的方法

    在用血液標本進行基因表達研究時，需要及時把新鮮血液中有核細胞的RNA提取出來。全血還不能直接放到-80℃保存，即使在-80℃保存，全血中的RNA也容易發生降解。傳統的提取新鮮全血RNA方法是把先把有核細胞從全血中分離出來，需要加白細胞分離液、離心等步驟，比較繁瑣，在臨床醫院往往難以實施，的RNA提取方法為RN01 TRIpure LS裂解全血提取RNA。

(一)淋巴細胞分離液分離單個核細胞：
    外周血及骨髓（抗凝）利用淋巴細胞分離液分離單個核細胞
（1）外周血送檢需5-10ml抗凝血，骨髓需1-3ml抗凝，常溫送檢(樣本量根據單個核細胞的數量來確定，一般需要5x106單個核細胞以上)。
（2）加入等體積無菌PBS于外周血及骨髓中充分混合，形成細胞懸液；
（3）加入5ml淋巴細胞分離液于另一離心管。
（4）吸取5ml細胞懸液沿管壁輕輕加入到淋巴細胞分離液表面（注意勿與淋巴細胞分離液混合）。離心1500rpm 20min。
（5）用吸管輕輕吸出界面層（白膜）中的MNC入另一離心管中。無菌冷PBS洗2次，zui后1次洗滌可以將細胞懸液移入EP管中，離心去上清直接或加入TRIzol混勻后-70℃凍存，或直接提取RNA（可以*行細胞計數以保證細胞數）。

(二)紅細胞裂解液分離單個核細胞：
（1）血液收集：用肝素抗凝，因為EDTA可能會對后續的pcr有影響，因為EDTA會螯合pcr反應中的Mg2+，也可以根據實驗的具體要求看選擇怎么樣的抗凝。
（2）白細胞的分離：一般選擇1.5ML新鮮的血液，或選取冷凍的5ML的血液（冷凍血液的保存：先液氮速凍，再置于-80°保存），或隔天的5ML的血液，就可以分離到比較多的白細胞了。可以選擇溶紅素或紅細胞裂解液按一定的比例（1：3或1：5）分離白細胞，一般在3500轉離心6分鐘即可，效果不好的話，可以重新裂解一次。
（3）分離得到的白細胞，立刻用質量好的TRIZOL裂解白細胞，如果不能馬上提取的話，可以置于-20或-80保存，過后抽提（選擇一般的組織或細胞的RNA抽提ELISA試劑盒即可）。

(三) RN01 TRIpure LS裂解全血提取RNA
    液體樣本RNA提取試劑RN01 TRIpure LS?？梢灾苯恿呀馊崛?/span>RNA，避免了先裂解白細胞可能導致的RNA降解，也大大簡化了操作步驟。操作時間比普通方法節約至少三分之一。

（1）在臨床上采血時，可以先把TRI pure LS Reagent分裝750ul到1.5ml的離心管中。
（2）血液樣本可以先抗凝處理（EDTA抗凝或者其他抗凝方式都可），然后取250ul全血樣品加入到750ul的TRI pure LS Reagent中，用移液槍反復抽打并振蕩混勻，在室溫裂解5min-10min，直至血細胞充分發生裂解。
（3）此裂解液保存在-20℃下可達2個月，-80℃可達半年，4℃可以1天。
（4）樣品在15 -30°C條件下孵育5分鐘以使核蛋白體*分解。
（5）每1ml TRIpure加0.2ml氯仿，蓋緊樣品管蓋，用手用力搖晃試管15秒并將其在室溫下孵育2~3分鐘。在2~8°C下以不超過12,000×g的離心力高速冷凍離心15分鐘。離心后混合物分成三層：下層*-氯仿層，中間層，上層無色的水樣層。RNA在于水樣層，水樣層的容量大約為所加TRIpure 容量的60%。
（6）將水樣層轉移到新EP管中(如果希望分離DNA和蛋白，有機層同樣要予以保留)，zui初均化時的每1ml TRIpure 對應0.5ml異丙醇，將混合的樣品在-15 -30°C條件下孵育10分鐘；
（7）在2~8°C下以不超過12,000×g的離心力高速冷凍離心10分鐘（RNA沉淀在離心前通常不可見，形成一膠狀片狀沉淀附著于試管壁和管底；
（8）移去上層懸液。用75%的乙醇洗滌RNA沉淀一次（每1ml的TRIpure 至少加1ml的75%乙醇），在2~8°C下以不超過7,500×g的離心力高速冷凍離心5分鐘；
（9）簡單干燥RNA沉淀（空氣干燥或真空干燥5~10分鐘，不能讓RNA沉淀*干燥那樣會極大地降低它的可溶性）。部分溶解的RNA樣品其A260/280比值<1.6。用移液管尖分幾次移取無RNA酶的水或0.5%SDS溶液來溶解RNA，RNA還能被甲酰胺（除去離子）再溶解并保存在–70°C。