血清蛋白聚丙烯酰胺凝膠盤狀電泳的實驗操作

    本實驗利用聚烯酰胺凝膠作電泳支持物。電荷和分子大小不一的各種血清蛋白質通過濃縮效應、電荷效應、分子篩效應而被精細地分離。由于具有以上三種效應，所以此方法分離效果好，分辨率高。血清蛋白在醋酸纖維素薄膜電泳僅能分成5~7個組份，而在聚丙烯酰胺凝膠盤狀電泳中可分出12~30個組份。

操作方法如下：

(一)凝膠柱的制備：

1．取已準備好的10×0.6cm的玻管，從一端量至7cm處，用玻璃臘筆劃線。起始端用膠布包封好后，插入橡皮塞中，垂直放好。

2．分離膠的制備：

(1)按分離膠配制表的比例(附后)，取1號、2號試劑和蒸餾水加入一小燒杯中，混合后，再加入3號和4號試劑，混勻后即成為分離膠溶液(此溶液約在半小時內聚合為聚丙烯酰胺凝膠，故應盡快操作。如室溫較高時，為防止過快聚合，可放置冰浴中操作。或根據聚合速度的快慢，適當調整TEMED的加入量)。

(2)用5ml注射器、18號針頭或用長細滴管吸取分離膠溶液，將其沿玻管管壁注入玻管，直至7cm劃線平面。

(3)用長細滴管吸取蒸餾水，沿管壁在分離膠的液面上加注0.5cm高的水層。加水時必須緩慢細流，盡量減少膠液表面的震動與混合。(加注水層是為了使凝膠聚合后的表面平整而不致出現彎月形，并能使凝膠與空氣隔絕。這一步很重要，它將直接影響分辨率與帶形)。

(4)將加注好的凝膠管靜置1小時，以進行聚合反應。在聚合過程中，起初凝膠與水層的界面逐漸消失，待膠體形成后，其界面又將重新可辨。這一現象可用來觀察判斷凝膠的聚合是否完成。

3．濃縮膠的制備

(1)按濃縮膠配制表的比例取2號、5號試劑和蒸餾水加入另一小燒杯中，混合后，再加入3號和4號試劑，混勻后即成為濃縮膠溶液。(在制備濃縮膠時，也常用核黃素催化的光聚合來代替過硫suan銨催化的化學聚合作用)。

(2)用滴管和濾紙小心地吸去已聚合好的分離膠膠面上的水液。注意切勿觸及膠面。

(3)用長細滴管或注射器吸取濃縮膠溶液，在分離膠膠面上沿玻管壁小地注入0.5~1cm高的膠液。然后同樣沿玻管壁緩慢細流地加入0.5cm高的蒸餾水。靜置一小時后即可使用。

在加樣之前先用滴管或濾紙小心地吸去濃縮膠膠面上的水液。

(二)加樣：

用50μl的微量注射器，取12μl血清，加12μl的40%蔗糖溶液(1∶1稀釋)，再加入40μl0.05%溴酚蘭指示劑，混勻。每管中加入該混合液16μl，共可加4管。每管實際加入純血清3μl，含蛋白質196μg。(血清蛋白質含量為6.2克/100毫升血清)

若需增減管數，亦照此加樣比例推算。

(三)電泳

(1)將加樣完畢的凝膠管上端垂直插入上電極槽底板的橡膠塞孔中。并去掉下端的橡皮塞和膠布。

(2)先用長細滴管吸取電極緩沖液，在已插好的凝膠管樣品液面上，小心地逐管加滿電極緩沖液。然后將電極緩沖液慢慢地倒入上、下電極槽中。注意避免和排除凝膠管的上、下管口內留有氣泡，否則會影響導電。電極緩沖液的加入量，上槽以電極能*浸入為宜，下槽以凝膠管浸入3/5為宜。

(3)將上槽的電極接電泳儀的負極，下槽的電極接電泳儀的正極。先調節電流為1mA/管，待示蹤染料進入分離膠后，再調節電流為2~3mA/管。待示蹤染料遷移至距管下口0.5cm時，切斷電源，電泳完畢。

(四)剝膠

取下凝膠管，用帶10cm長針頭的注射器吸取蒸餾水作潤滑針。將針頭小心插入管壁與膠柱之間，一邊注水，一邊使針頭緊貼管壁慢慢呈螺旋式前進。如果一頭不行，再在另一頭按同樣的方法剝離，直至膠柱與管壁分開，從玻管中滑出。如膠柱不能滑出，可用洗耳球從一端加壓吹出。

(五)固定、染色及漂洗：

將剝出的膠柱浸入8號試劑60℃水浴30-60分鐘，進行染色，然后用清水沖洗掉多余的染料。