關于ELISA樣本值低于空白值的問題

在ELISA實驗中，樣本值低于空白值是一個經常性的問題。當樣本值較低接近試劑盒的靈敏度就容易發生樣本值低于空白值的現象，特別是在血清和血漿樣本的檢測。究其原因，主要在于兩個方面，一方面是誤差，另一方面是基質效應。下文逐個分析不同影響因素的原理、和解決方案。

一、誤差 Error

誤差分為三類，系統誤差、隨機誤差和過失誤差。這三類誤差中，系統誤差對樣本值和空白值之間的差異無影響。ELISA樣本值低于空白值在誤差方面主要來源于隨機誤差和過失誤差。

1、 隨機誤差 Random Error

無法控制的變因，使測量值產生隨機分布的誤差，服從統計學上的正態分布。從統計學上來看，測量值有99%的置信限在±3SD之間，如果CV值是20%，隨機誤差的邊界就是±60%，也就是說在CV值20%的狀況下，樣本值低于空白值60%之內，有可能是隨機誤差的影響，特別是空白值只有一個值時。

隨機誤差不可消除，只能通過多次測量獲得的均值盡量逼近真值。降低隨機誤差的解決方案1是增加空白值的重復數量，一般認為空白值重復10次，測量均值接近真值。

方案2是提高實驗技能，也能夠有效降低隨機誤差的影響。如果CV值在5%，樣本值趨近于零時，在統計上樣本值將不會低于空白值15%。

2、 過失誤差 Gross Error

過失誤差主要是由于測量者的疏忽，犯了不應有的錯誤造成的。過失誤差是可以避免的。針對于ELISA樣本值低于空白值的問題，過失誤差產生的原因多數來源于空白孔HRP的重復加樣或污染或洗滌不干凈，造成空白值偏高，相對比來說，樣本值低于空白值。解決方案就是重復實驗，規范操作。

二、基質效應 Matrix Effect

分析中，基質指的是樣本中被分析物之外的組分，基質常常對分析物的分析過程有顯著的干擾，并影響分析結果的準確性，這些影響和干擾被稱為基質效應。ELISA試劑盒在開發過程中，標準品不能采用人或動物血清、血漿作為標準曲線的稀釋液，只能采用其模擬物。模擬物與被測樣本在蛋白豐度、復雜性、pH等因素都會存在差異。當樣本的基質與其模擬物相比，降低抗原抗體的結合，便產生了樣本值低于空白值的現象。造成樣本值無法計算出數值，或者數值為負。

目前常用的去除基質效應的方法是，通過已知分析物濃度的標準樣品，同時盡可能保持樣本中的基質不變，建立一個校正曲線（Calibration Curve）。

當單個樣本或少量樣本值低于空白值時，可能是誤差原因，這時應增加重復，提高操作技能。當大量樣本都低于空白值時，應考慮基質效應的影響，建立校正曲線予以修正。