ELISA實(shí)驗(yàn)操作注意事項(xiàng)

一、關(guān)于夾心ELISA

夾心ELISA測(cè)定兩層抗體（即捕獲抗體和檢測(cè)抗體）間的抗原。靶抗原必須包含至少兩個(gè)能夠結(jié)合到抗體的抗原位點(diǎn)。

夾心ELISA去掉了分析前的樣品純化步驟，提高了靈敏度（比直接或間接法靈敏2–5倍）。

二、實(shí)驗(yàn)步驟

1.用捕獲抗體包被

①以捕獲抗體濃度為1-10μg/mL的碳酸鹽/碳酸氫鹽緩沖液 (pH9.6)包被PVC微量滴定板的孔。
②未純化抗體（例如腹水液或抗血清）可能需要增加樣品蛋白質(zhì)的濃度（嘗試用10μg/mL）補(bǔ)償濃度更低的特異性抗體。
③用粘合塑料制品覆蓋微量滴定板并在4℃下孵育過(guò)夜。
④棄去包被液，并洗滌微量滴定板兩次，每次在微孔中加入200μLPBS。在水槽上方輕輕甩動(dòng)微量滴定板，除去溶液或洗滌液。在紙巾上輕拍微量滴定板，除去剩余的液滴。?

2.封閉和加樣
①每孔添加 200μL 封閉緩沖液（5% 脫脂奶粉/PBS）封閉包被孔中剩余的蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)。
②用粘合塑料制品覆蓋微量滴定板并在室溫下孵育至少1-2小時(shí)，或在4℃下孵育過(guò)夜。
③用200 μL PBS洗滌微量滴定板兩次。
④將100 μL 稀釋樣品添加到每個(gè)孔。通常做法是比較未知樣品與標(biāo)準(zhǔn)曲線的信號(hào)。每板都必須測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)品（兩重測(cè)定或三重測(cè)定）和空白樣品。37°C條件下孵育90分鐘。確保標(biāo)準(zhǔn)品濃度涵蓋抗體結(jié)合的大部分動(dòng)態(tài)檢測(cè)范圍。可能需要優(yōu)化濃度范圍以獲得合適的標(biāo)準(zhǔn)曲線。通常樣品和標(biāo)準(zhǔn)品采取兩重測(cè)定或三重測(cè)定。
⑤移除樣品，用200μL PBS洗滌微量滴定板兩次。

3.用檢測(cè)抗體和二抗孵育

①將100μL稀釋的檢測(cè)抗體添加到每個(gè)孔。?確保檢測(cè)抗體識(shí)別與捕獲抗體靶蛋白的不同表位。這可防止對(duì)抗體結(jié)合的干擾。盡可能使用已測(cè)試的成對(duì)匹配抗體。
②用粘合塑料制品覆蓋微量滴定板并在室溫下孵育2小時(shí)。
③用PBS洗滌微量滴定板四次。
④添加100μL偶聯(lián)二抗，使用前將其在封閉緩沖液中稀釋。
⑤用粘合塑料制品覆蓋微量滴定板并在室溫下孵育1-2小時(shí)。
⑥用PBS洗滌微量滴定板四次。

三、檢測(cè)

辣根過(guò)氧化物酶(HRP)和堿性磷酸酶(ALP)是ELISA測(cè)定法中常用的兩種檢測(cè)酶。

考慮到某些生物材料具有高水平內(nèi)源酶活性（例如肺泡細(xì)胞中的高水平ALP、紅細(xì)胞中的高水平過(guò)氧化物酶），這可能會(huì)導(dǎo)致非特異性信號(hào)。如有必要，用左旋咪唑（針對(duì)ALP）或用0.3% H2O2的甲醇溶液（針對(duì)過(guò)氧化物酶）進(jìn)行另外的阻斷處理。

ALP底物

對(duì)硝基苯磷酸鹽(pNPP)是大多數(shù)應(yīng)用常用的底物。室溫孵育15–30分鐘后在405 nm處測(cè)定硝基苯酚呈現(xiàn)的黃色，并加入等量0.75M NaOH 終止反應(yīng)。

HRP顯色液

HRP的底物為過(guò)氧化氫。過(guò)氧化氫的裂解與氫供體的氧化偶聯(lián)，反應(yīng)期間氫供體的氧化使顏色發(fā)生變化。

TMB（3,3’,5,5’-四甲基聯(lián)苯胺）

將TMB溶液添加到每個(gè)孔，孵育15-30分鐘，添加等體積的終止液(2M H2SO4)，然后在450nm 處讀取光密度。

OPD（鄰苯二胺二yan酸鹽）

在492 nm下測(cè)定終產(chǎn)物。底物對(duì)光敏感，應(yīng)將其存放在暗處。

ABTS（2,2’-聯(lián)氮-雙-[3-乙基-苯并噻唑啉-6 磺酸] 二銨鹽）

終產(chǎn)物為綠色，可在416nm處測(cè)定光密度。

某些酶底物被認(rèn)為是有害的（潛在致癌物），因此應(yīng)始終小心處理并佩戴手套。

四、數(shù)據(jù)分析

由系列稀釋液得到的數(shù)據(jù)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，濃度標(biāo)在X軸（對(duì)數(shù)標(biāo)度）上，而吸光度標(biāo)在Y軸（線性標(biāo)度）上。通過(guò)內(nèi)插法在此標(biāo)準(zhǔn)曲線上得出樣品濃度。