進口細胞株蛋白的作用以及相互作用分析

    進口細胞株蛋白（Cytoglobin,Cygb）是一種細胞內抗氧化蛋白，是近發現的脊椎動物珠蛋白超家族中的一員，它具有保護細胞、抑制腫瘤細胞增長的功能。進行酵母雙雜交文庫構建，篩選出與CYGB相互作用的蛋白，為進一步研究CYGB的功能機制奠定基礎。酵母雙雜交文庫構建是篩庫的前提，可用于目的蛋白的互作蛋白大規模篩選分析蛋白質間的相互作用，是現在分子生物學與生物化學常用的手段。

    酵母雙雜交技術是一種具有很高靈敏度的研究蛋白質之間關系的技術，大的優點就是不需要分離純化蛋白質，整個過程只是對核酸進行操作，同時充分利用酵母生長速度快、易于操作等特點，酵母雙雜交文庫構建一般包括核體系和膜體系兩種方法。美迪西提供酵母雙雜交服務，具有獨立實驗室，專業實驗人員，提供詳細的酵母雙雜交實驗步驟、原始數據和圖片、結果分析，可以出具檢測數據報告。

    進口細胞株蛋白初由日本Tawada等在2001年在大鼠纖維化肝臟的星狀細胞中發現了此種蛋白。由于其具有緊湊的螺旋形結構和結合血紅素的能力，可可逆的結合各類氣體分子，如氧氣、一氧化氮等。Cygb在缺氧時表達上調且特定地表達在毛細血管周圍，提示其可能具有氧感受器的作用。Cybd可以作為清道夫，清除組織缺血后再灌注時產生的ROS和NO分子。此外它還具有過氧化氫酶活性，在肝星狀細胞中其過氧化物清除劑的作用。研究顯示，Cygb對肝纖維化的逆轉有著非常顯著的作用。

    Cygb具有預防肝纖維化、實現肝纖維化逆轉的功能，且其作用是通過調控HSC的激活狀態實現的，與肝臟中細胞及細胞外基質間的氧化應激密切相關。有研究者選取了兩種肝臟中有代表性的氧化模型，過氧化氫模型及鐵過載模型，系統性研究了Cygb在肝纖維化氧化應激中發揮的具體作用，并結合microRNA(miRNA)技術，初步探索了Cygb在肝星狀細胞激活時表達上調的可能性機制。該研究為全面闡釋Cygb這一治療基因的抗氧化作用及機制、加速藥物新靶點開發提供了理論依據。
有研究者通過酵母雙雜交篩選出17個與Cygb相互作用的蛋白，環指蛋白2(RNF2)是其中之一，為進一步研究Cygb的功能機制奠定基礎。首先進行酵母雙雜交文庫構建，篩選Mate&PlateTMLibrary-UniversalHuman(Normalized)人源標準化cDNA文庫，尋找與Cygb相互作用的蛋白，然后研究者通過酵母回復性雜交實驗和免疫共沉淀實驗進一步驗證Cygb與RNF2之間的相互作用。

    環指蛋白2(RNF2)屬于多梳家族，是多梳抑制復合物1(PRC1)中的一員。RNF2可以介導組蛋白H2A的泛素化，因此RNF2在多梳結構介導的基因抑制中發揮重要作用。RNF2作為PRC1家族的一員，在胃癌、結腸癌、淋巴癌等多種癌癥中高表達。RNF2具有原癌基因的活性，敲除RNF2的HeLa細胞形態會發生改變，,細胞增殖也會受到抑制。RNF2是一種E3連接酶，與P53具有直接的相互作用，在人結腸癌HCT116細胞系中它可以以p53為靶點通過蛋白酶體途徑，促進p53的降解，從而影響P53下游基因的表達水平，以調節細胞周期和細胞凋亡。

    據此研究者推測Cygb與RNF2之間的相互作用很可能與腫瘤的發生發展具有一定的關聯性。該研究具有以下作用:
   （1）成功構建了pGBKT7-Cygb重組表達載體，該重組質粒在Y2HGold酵母菌株成功表達BD-Cygb-MYC融合蛋白，且Cygb誘餌蛋白對Y2HGold酵母細胞無毒性作用、無自激活活性。實驗結果表明，pGBKT7-Cygb酵母誘餌表達載體構建成功，可以用于文庫篩選。
   （2）以pGBKT7-Cygb重組質粒為誘餌從Mate&PlateTMLibrary-UniversalHuman(Normalized)文庫中篩選CYGB的相互作用蛋白，終得到32個藍色的陽性克隆。陽性克隆質粒的PCR產物經測序鑒定、比對初步得到了17個細胞珠蛋白的相互作用基因。其中RNF2、SLC7A13、ATP1B1這三個基因重復出現多次。RNF2基因一共重復出現11次，并且與癌癥相關，是研究者們驗證和深入研究的重點。
   （3）經酵母回復性雜交實驗證明在酵母中RNF2確實能與Cygb發生相互作用。經免疫共沉淀實驗證明RNF2和Cygb在HEK293T細胞中發生了相互作用。
   （4）在人結腸癌HCT116細胞中，Cygb過表達可以提高RNF2的mRNA水平，降低P53和P21的mRNA水平。提示Cygb很可能正向調控RNF2，從而影響腫瘤的發生發展。

    通過酵母雙雜交系統篩選出與進口細胞株蛋白相互作用蛋白的研究，為進一步加深對進口細胞株蛋白生物學功能的認識，和為治療肝纖維化等疾病提供堅實的理論基礎。