細胞凍存實驗的實驗步驟

    實驗原理:

    在不附加任何條件下直接凍存細胞時，細胞內外環境中的水會結成冰晶，能導致細胞發生一系列變化，如機械損傷、電解質升高、滲透壓改變、脫水、pH 改變、蛋白質變性等等，終導致細胞死亡。但如向細胞培養液中加入保護劑甘油或二甲基亞砜（DMSO），可使冰點降低，在緩慢的凍結條件下，能使細胞內水分在凍結前透出細胞外，可避免上述現象的發生。凍存在－135 ℃以下低溫中，能減少冰晶的形成。而融化細胞時速度則要快，使之迅速通過易受損的－5~0 ℃以后，細胞活力不受損害，仍能生長增殖。當前常用的保護劑仍為甘油和DMSO，它們對細胞無毒、分子量小、溶解度大、易穿透細胞，使用范圍在5%~15 %之間，常用10 %。

    實驗步驟:

    1.細胞

    選項對數生長期細胞；收集細胞24 小時前換液一次；

    2、制備細胞懸液：
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    （1）用75%酒精棉球消毒超凈工作臺臺面，然后用75%酒精棉球消毒雙手及暴露部位；

    （2）用75%酒精棉球消毒各培養用液的瓶蓋以及培養瓶瓶蓋部位，并在酒精燈外焰上方一過，擰開瓶蓋，將瓶口再在酒精燈外焰上方一過后，擰上瓶蓋，但不要擰緊，以便下步操作；?

    （3）輕輕將細胞培養瓶內舊培養液倒入燒杯中，注意不要讓瓶口碰到燒杯，不要讓液體濺出；

    （4）吸取PE液3ml加入瓶內，加入時注意從側面加入而不能直接沖細胞貼壁處，避免造成細胞脫壁，然后蓋上蓋子，平放輕搖40下，輕輕倒出，要求倒干凈；

    （5）加入0.3ml的0.25%胰蛋白酶液，加入時直沖細胞貼壁處，平放輕搖，使酶液漫過整個瓶底部，一分鐘之內將培養瓶放在倒置顯微鏡臺上進行觀察，可發現細胞質漸漸回縮，細胞間隙增大，細胞慢慢變圓，用手掌拍打瓶底和瓶側，使細胞從瓶壁上脫落下來并分散，呈懸浮狀；

    （6）立即加入5mlMEM+10%小牛血清，用吸管向瓶壁輕輕吹吸幾次，從培養瓶底部一邊開始到另一邊結束，以確保所有底部都被吹到，使細胞全部從瓶壁脫落并形成均勻的細胞懸液；

    3、按常規法把細胞制成細胞懸液，計數、令細胞密度達5×106 /ml （如一瓶細胞數量不足則用兩瓶或更多的細胞），離心去上清， 吸入離心管中；先用培養液9 分+DMSO 1 分（或甘油）配成10%的DMSO凍存液；按上法一滴滴加入離心管中，然后用吸管輕輕吹打令細胞重懸；分裝入無菌安瓿中，每安瓿加1.5 毫升細胞懸液；

    4、封口

    用塑料安瓿時擰緊瓶口即可；如用火焰封閉安瓿口后，仔細檢查，定要封嚴，必要時可浸入藍色液中觀察，為安全起見，把安瓿縫入紗布小袋中，以防液氮浸入后，融解時因受熱發生爆炸傷人；紗袋一端系以線繩，末端扎有小牌，注明：細胞名稱，凍存日期，以便日后查找；

    5、凍存

    當前已有細胞凍存器；在無凍存器的情況下，可用手工辦法；從把凍存物懸在液氮罐口開始算起，按－1 ℃分鐘速度，在30~40 分鐘內，下降到液氮面，再停30 分鐘后，直投入液氮中。