研究表明孕激素對人子宮內膜上皮細胞FUT7的方法有哪些？

細胞培養：
RL95-2 細胞在 DMEM/F12(1:1)的培養液(含 10%胎牛血清，10mmol/lHEPERS，5g/ml 胰島素，100IU/ml青霉素，和100g/ml鏈霉素)中培養，pH7.4。 37℃, 5% CO2,飽和濕度條件下培養。每 2-3 天換液一次，倒置顯微鏡下觀察細胞生長狀況。在細胞生長對數期，消化離心后重懸，細胞計數為 1×106 個/ml,接種于六孔培養板，待細胞長滿后，加入無血清的培養基饑餓24小時。在不同孔中分別加入孕激素，其終濃度分別為10-5mol/l, 10-6mol/l,10-7mol/l， 10-8mol/l；加入無血清的培養基作空白對照；加入孕激素和米非司酮，終濃度均為 10-5mol/l。在 37℃, 5% CO2 的培養箱中培養24小時，收集細胞檢測。

RT-PCR：
采用RNA快速抽提純化試劑盒(Qiagen)提取組織RNA, 操作按試劑盒說明書要求進行。cDNA體外合成條件為50℃45min,99℃5min。 PCR反應條件為: 94℃預變性5min;95℃變性30s, 57℃退火30s, 72℃延伸50s, 35個循環; zui后72℃延伸5 min。

Western blot：
細胞加入蛋白質裂解液中(每1000mlPBS中加入l0 mlNP-40和10mlPMSF (上海滬鼎生物科技有限公司)。充分混勻后置于4℃靜置2h, 4℃,11000×g離心15min, 將上清置于新的EP管中。考馬斯亮藍法進行蛋白估量后, 進行Western blotting 分析。所用一抗為羊抗人FUT7(Santa Cruz Biotech),1∶200 使用或sLeX(Santa Cruz Biotech) 1∶300使用; 二抗（生物素化抗羊IgG1:800，或生物素化抗鼠 IgM1:500，1%TTBS 稀釋） 37℃孵育45分鐘；三抗（AP標記鏈霉卵白素1:800，1%TTBS稀釋）37℃孵育45分鐘；加入AP反應底物NBT/BCIP，避光處顯色5-20分鐘，蒸餾水清洗終止反應。

免疫熒光染色：
細胞置24孔培養板內蓋玻片上培養。經不同處理后，取出蓋玻片, PBS沖洗后于4%-3-多聚甲醛/PBS4℃固定30min，于0.2%TritonX-100/PBS室溫下處理10min，再經3%BSA(Sigma)/PBS37℃封閉2h后, 取出玻片, 置1∶300FuT7羊抗鼠多克隆抗體(SantaCruz Biotech)或1∶200sLeX抗體中, 37℃孵育2h(或 4℃過夜), 經清洗后, 加入1∶100 FITC標記的上海滬鼎生物科技有限公司兔抗羊IgG或TRITC標記的抗鼠sLeX二抗, 37℃孵育1h; zui后以甘油封片, 于熒光顯微鏡下觀察并照相記錄結果。