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    ELISA試劑盒、人轉移趨化生長因子β1ELISA檢測試劑盒說明書

    時間:2014-5-27閱讀:332
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        ELISA試劑盒是固相夾心法酶聯免疫吸附實驗(ELISA).已知TGF-β1濃度的標準品、未知濃度的樣品加入微孔酶標板內進行檢測。先將TGF-β1和*標記的抗體同時溫育。洗滌后,加入親和素標記過的HRP。再經過溫育和洗滌,去除未結合的酶結合物,然后加入底物A、B,和酶結合物同時作用。產生顏色。顏色的深淺和樣品中TGF-β1的濃度呈比例關系。

     

    試劑盒內容及其配制

    試劑盒成份(2-8℃保存)

    96孔配置

    48孔配置

    配制

    96/48人份酶標板

    1塊板(96T)

    半塊板(48T)

    即用型

    塑料膜板蓋

    1塊

    半塊

    即用型

    標準品:400pmol/L

    1瓶(0.6ml)

    1瓶(0.3ml)

    按說明書進行稀稀

    空白對照

    1瓶(1.0ml)

    1瓶(0.5ml)

    即用型

    標準品稀釋緩沖液

    1瓶(5ml)

    1瓶(2.5ml)

    即用型

    *標記的抗TGF-β1抗體

    1瓶(6ml)

    1瓶(3.0ml)

    即用型

    親和鏈酶素-HRP

    1瓶(10ml)

    1瓶(5.0ml)

    即用型

    洗滌緩沖液

    1瓶(20ml)

    1瓶(10ml)

    按說明書進行稀釋

    底物A

    1瓶(6.0ml)

    1瓶(3.0ml)

    即用型

    底物B

    1瓶(6.0ml)

    1瓶(3.0ml)

    即用型

    終止液

    1瓶(6.0ml)

    1瓶(3.0ml)

    即用型

     

    自備材料

    蒸餾水。
    加樣器:5ul、10ul、50ul、100ul、200ul、500ul、1000ul。
    振蕩器及磁力攪拌器等。

     

    安全性

    避免直接接觸終止液和底物A、B。一旦接觸到這些液體,請盡快用水沖洗。
    實驗中不要吃喝、抽煙或使用化妝品。
    不要用嘴吸取試劑盒里的任何成份。

     

     

    操作注意事項

       ELISA試劑盒試劑應按標簽說明書儲存,使用前恢復到室溫。稀稀過后的標準品應丟棄,不可保存。
    實驗中不用的板條應立即放回包裝袋中,密封保存,以免變質。
    不用的其它試劑應包裝好或蓋好。不同批號的試劑不要混用。保質前使用。
    使用一次性的吸頭以免交叉污染,吸取終止液和底物A、B液時,避免使用帶金屬部分的加樣器。
    使用干凈的塑料容器配置洗滌液。使用前充分混勻試劑盒里的各種成份及樣品。
    洗滌酶標板時應充分拍干,不要將吸水紙直接放入酶標反應孔中吸水。
    底物A應揮發,避免長時間打開蓋子。底物B對光敏感,避免長時間暴露于光下。避免用手接觸,有毒。實驗完成后應立即讀取OD值。
    加入試劑的順序應一致,以保證所有反應板孔溫育的時間一樣。
    按照說明書中標明的時間、加液的量及順序進行溫育操作。

     

    樣品收集、處理及保存方法

    血清-----操作過程中避免任何細胞刺激。使用不含熱原和內毒素的試管。收集血液后,1000×g離心10分鐘將血清和紅細胞迅速小心地分離。
    血漿-----EDTA、檸檬酸鹽、肝素血漿可用于檢測。1000×g離心30分鐘去除顆粒。
    細胞上清液---1000×g離心10分鐘去除顆粒和聚合物。
    保存------如果樣品不立即使用,應將其分成小部分-70 ℃保存,避免反復冷凍。盡可能的不要使用溶血或高血脂血。如果血清中大量顆粒,檢測前先離心或過濾。不要在37℃或更高的溫度加熱解凍。應在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。

     

    試劑的準備

    標準品:標準品的系列稀釋應在實驗時準備,不能儲存。稀釋前將標準品振蕩混勻。稀釋比例按下表中進行:

    400 pmol/L

    (6號標準品)

    原倍濃度不用稀釋直接加入50ul。

    200 pmol/L

    (5號標準品)

    100ul的原倍標準品加入100ul的標準品稀釋液

    100 pmol/L

    (4號標準品)

    100ul的5號標準品加入100ul的標準品稀釋液

    50 pmol/L

    (3號標準品)

    100ul的4號標準品加入100ul的標準品稀釋液

    25 pmol/L

    (2號標準品)

    100ul的3號標準品加入100ul的標準品稀釋液

    12.5 pmol/L

    (1號標準品)

    100ul的2號標準品加入100ul的標準品稀釋液

    0 pmol/L

    (空白對照)

    原始濃度不用稀釋直接加入50ul。

     

    洗滌緩沖液(50×)的稀釋:蒸餾水50倍稀釋。

     

    操作步驟

    使用前,將所有試劑充分混勻。不要使液體產生大量的泡沫,以免加樣時加入大量的氣泡,產生加樣上的誤差。
    根據待測樣品數量加上標準品的數量決定所需的板條數。每個標準品和空白孔建議做復孔。每個樣品根據自己的數量來定,能使用復孔的盡量做復孔。
    加入稀釋好后的標準品50ul于反應孔、加入待測樣品50ul于反應孔內。立即加入50ul的*標記的抗體。蓋上膜板,輕輕振蕩混勻,37℃溫育1小時。
    甩去孔內液體,每孔加滿洗滌液,振蕩30秒,甩去洗滌液,用吸水紙拍干。重復此操作3次。如果用洗板機洗滌,洗滌次數增加一次。
    每孔加入80ul的親和鏈酶素-HRP,輕輕振蕩混勻,37℃溫育30分鐘。
    甩去孔內液體,每孔加滿洗滌液,振蕩30秒,甩去洗滌液,用吸水紙拍干。重復此操作3次。如果用洗板機洗滌,洗滌次數增加一次。
    每孔加入底物A、B各50ul,輕輕振蕩混勻,37℃溫育10分鐘。避免光照。
    取出酶標板,迅速加入50ul終止液,加入終止液后應立即測定結果。
    在450nm波長處測定各孔的OD值。

     

    建議使用的實驗方案

     

    標準品濃度(pmol/L)

     

    A

    400

    400

    樣品

    樣品

    樣品

    樣品

    樣品

    樣品

    樣品

    樣品

    樣品

    樣品

    B

    200

    200

    樣品

    樣品

    樣品

    樣品

    樣品

    樣品

    樣品

    樣品

    樣品

    樣品

    C

    100

    100

    樣品

    樣品

    樣品

    樣品

    樣品

    樣品

    樣品

    樣品

    樣品

    樣品

    D

    50

    50

    樣品

    樣品

    樣品

    樣品

    樣品

    樣品

    樣品

    樣品

    樣品

    樣品

    E

    25

    25

    樣品

    樣品

    樣品

    樣品

    樣品

    樣品

    樣品

    樣品

    樣品

    樣品

    F

    12.5

    12.5

    樣品

    樣品

    樣品

    樣品

    樣品

    樣品

    樣品

    樣品

    樣品

    樣品

    G

    0

    0

    樣品

    樣品

    樣品

    樣品

    樣品

    樣品

    樣品

    樣品

    樣品

    樣品

    H

    樣品

    樣品

    樣品

    樣品

    樣品

    樣品

    樣品

    樣品

    樣品

    樣品

    樣品

    樣品

     

     

    局限

    6號標準品以上的結果為非線性的,根據此標準曲線無法得到的結果。

     

    ELISA試劑盒性能

    1. 靈敏度:zui小的檢測濃度小于1號標準品。稀釋度的線性。樣品線性回歸與預期濃度相關系數R值為0.990。

    2. 特異性:不與其它細胞因子反應。

    3. 重復性:板內、板間變異系數均小于10%。

     

    結 果 判 斷 與 分 析

    1、儀器值:于波長450nm的酶標儀上讀取各孔的OD值

     

    2、以吸光度OD值為縱坐標(Y),相應的TGF-β1標準品濃度為橫坐標(X),做得相應的曲線,樣品的TGF-β1含量可根據其OD值由標準曲線換算出相應的濃度。

     

    3、檢測值范圍:0-400pmol/L

     

    4、敏感度: 1.0 pmol/L

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