牛腹瀉病毒酶聯免疫分析僅供研究使用

牛腹瀉病毒酶聯免疫分析實驗原理：
    本試劑盒采用雙抗體夾心酶聯免疫法（ELISA）測定標本中牛腹瀉病毒 （DV）。用純化的牛腹瀉病毒 （DV）抗體包被微孔板，制成固相抗體，可與樣品中腹瀉病毒 （DV）相結合，經洗滌除去未結合的抗體和其他成分后再與HRP標記的腹瀉病毒 （DV）抗體結合，形成抗體-抗原-酶標抗體復合物，經過*洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成zui終的黃色。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），與CUTOFF值相比較，從而判定標本中牛腹瀉病毒 （DV）的存在與否。 

試劑盒組成：
試劑盒組成    48孔配置    96孔配置    保存
說明書    1份    1份     
封板膜    2片（48）    2片（96）     
密封袋    1個    1個     
酶標包被板    1×48    1×96    2-8℃保存
陰性對照    0.5ml×1瓶    0.5ml×1瓶    2-8℃保存
陽性對照    0.5ml×1瓶    0.5ml×1瓶    2-8℃保存
酶標試劑    3 ml×1瓶    6 ml×1瓶    2-8℃保存
樣品稀釋液    3 ml×1瓶    6 ml×1瓶    2-8℃保存
顯色劑A液    3 ml×1瓶    6 ml×1瓶    2-8℃保存
顯色劑B液    3 ml×1瓶    6 ml×1瓶    2-8℃保存
終止液    3ml×1瓶    6ml×1瓶    2-8℃保存
濃縮洗滌液    （20ml×20倍）×1瓶    （20ml×30倍）×1瓶    2-8℃保存
 
樣本處理及要求：
1. 血清：室溫血液自然凝固10-20分鐘，離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清，保存過程中如出現沉淀，應再次離心。
2. 血漿：應根據標本的要求選擇EDTA或檸檬酸鈉作為抗凝劑，混合10-20分鐘后，離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應該再次離心。
3. 尿液：用無菌管收集，離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應再次離心。胸腹水、腦脊液參照實行。
4. 細胞培養上清：檢測分泌性的成份時，用無菌管收集。離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清。檢測細胞內的成份時，用PBS（PH7.2-7.4）稀釋細胞懸液，細胞濃度達到100萬/ml左右。通過反復凍融，以使細胞破壞并放出細胞內成份。離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清。保存過程中如有沉淀形成，應再次離心。
5. 組織標本：切割標本后，稱取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷凍保存備用。標本融化后仍然保持2-8℃的溫度。加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或勻漿器將標本勻漿充分。離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清。分裝后一份待檢測，其余冷凍備用。
6. 標本采集后盡早進行提取，提取按相關文獻進行，提取后應盡快進行實驗。若不能馬上進行試驗，可將標本放于-20℃保存，但應避免反復凍融.
7. 不能檢測含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。
牛腹瀉病毒酶聯免疫分析操作步驟：
1. 編號：將樣品對應微孔按序編號，每板應設陰性對照2孔、陽性對照2孔、空白對照1孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同）
2. 加樣：分別在陰、陽性對照孔中加入陰性對照、陽性對照50μl。然后在待測樣品孔先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測樣品10μl。加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻，
3. 溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。   
4. 配液：將30（48T的20倍）倍濃縮洗滌液加蒸餾水至600ml后備用
5. 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復5次，拍干。
6. 加酶：每孔加入酶標試劑50μl，空白孔除外。 
7. 溫育：操作同3。
8. 洗滌：操作同5。
9. 顯色：每孔先加入顯色劑A 50μl，再加入顯色劑B 50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15分鐘
10. 終止：每孔加終止液50μl，終止反應（此時藍色立轉黃色）。
11. 測定：以空白空調零，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。 測定應在加終止液后15分鐘以內進行。
牛腹瀉病毒酶聯免疫分析結果判定：
  試驗有效性：陽性對照孔平均值≥1.00; 陰性對照平均值≤0.10
  臨界值（CUT OFF）計算：臨界值=陰性對照孔平均值+0.15
  陰性判定：樣品OD值< 臨界值（CUT OFF）者為腹瀉病毒 （DV）陰性
  陽性判定：樣品OD值≥ 臨界值（CUT OFF）者為腹瀉病毒 （DV）陽性
注意事項
1．操作嚴格按照說明書進行，本試劑不同批號組分不得混用。
2．試劑盒從冷藏環境中取出應在室溫平衡15-30分鐘后方可使用，酶標包被板開封后如未用完，板條應裝入密封袋中保存。
3．濃洗滌液可能會有結晶析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶，洗滌時不影響結果。
4． 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。
5．底物請避光保存。
6．試驗結果判定必須以酶標儀讀數為準，使用雙波長檢測時，參考波長為630nm
7．所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應按傳染物處理。終止液為2M的硫酸，使用時必須注意安全。
保存條件及有效期
1．試劑盒保存：；2-8℃。
2．有效期：6個月