ELISA試劑盒，人內(nèi)皮抑素ELISA檢測試劑盒技術(shù)原理

ELISA試劑盒試驗原理：
ES試劑盒是固相夾心法酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）.已知ES濃度的標準品、未知濃度的樣品加入微孔酶標板內(nèi)進行檢測。先將ES和*標記的抗體同時溫育。洗滌后，加入親和素標記過的HRP。再經(jīng)過溫育和洗滌，去除未結(jié)合的酶結(jié)合物，然后加入底物A、B，和酶結(jié)合物同時作用。產(chǎn)生顏色。顏色的深淺和樣品中ES的濃度呈比例關(guān)系。

試劑盒內(nèi)容及其配制
試劑盒成份（2-8℃保存）
96孔配置
48孔配置
配制

96/48人份酶標板
1塊板（96T）
半塊板（48T）
即用型

塑料膜板蓋
1塊
半塊
即用型

標準品：240pg/ml
1瓶（0.6ml）
1瓶（0.3ml）
按說明書進行稀稀

空白對照
1瓶（1.0ml）
1瓶（0.5ml）
即用型

標準品稀釋緩沖液
1瓶（5ml）
1瓶（2.5ml）
即用型

*標記的抗ES抗體
1瓶（6ml）
1瓶（3.0ml）
即用型

親和鏈酶素-HRP
1瓶（10ml）
1瓶（5.0ml）
即用型

洗滌緩沖液
1瓶（20ml）
1瓶（10ml）
按說明書進行稀釋

底物A
1瓶（6.0ml）
1瓶（3.0ml）
即用型

底物B
1瓶（6.0ml）
1瓶（3.0ml）
即用型

終止液
1瓶（6.0ml）
1瓶（3.0ml）
即用型

ELISA試劑盒操作注意事項
試劑應(yīng)按標簽說明書儲存，使用前恢復(fù)到室溫。稀稀過后的標準品應(yīng)丟棄，不可保存。
實驗中不用的板條應(yīng)立即放回包裝袋中，密封保存，以免變質(zhì)。
不用的其它試劑應(yīng)包裝好或蓋好。不同批號的試劑不要混用。保質(zhì)前使用。
使用一次性的吸頭以免交叉污染，吸取終止液和底物A、B液時，避免使用帶金屬部分的加樣器。
使用干凈的塑料容器配置洗滌液。使用前充分混勻試劑盒里的各種成份及樣品。
洗滌酶標板時應(yīng)充分拍干，不要將吸水紙直接放入酶標反應(yīng)孔中吸水。
底物A應(yīng)揮發(fā)，避免長時間打開蓋子。底物B對光敏感，避免長時間暴露于光下。避免用手接觸，有毒。實驗完成后應(yīng)立即讀取OD值。
加入試劑的順序應(yīng)一致，以保證所有反應(yīng)板孔溫育的時間一樣。
按照說明書中標明的時間、加液的量及順序進行溫育操作。

樣品收集、處理及保存方法
血清-----操作過程中避免任何細胞刺激。使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管。收集血液后，1000×g離心10分鐘將血清和紅細胞迅速小心地分離。
血漿-----EDTA、檸檬酸鹽、肝素血漿可用于檢測。1000×g離心30分鐘去除顆粒。
細胞上清液---1000×g離心10分鐘去除顆粒和聚合物。
保存------如果樣品不立即使用，應(yīng)將其分成小部分-70 ℃保存，避免反復(fù)冷凍。盡可能的不要使用溶血或高血脂血。如果血清中大量顆粒，檢測前先離心或過濾。不要在37℃或更高的溫度加熱解凍。應(yīng)在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。

試劑的準備
標準品：標準品的系列稀釋應(yīng)在實驗時準備，不能儲存。稀釋前將標準品振蕩混勻。稀釋比例按下表中進行：
240 pg/ml
（6號標準品）
原倍濃度不用稀釋直接加入50ul。

120 pg/ml
（5號標準品）
100ul的原倍標準品加入100ul的標準品稀釋液

60 pg/ml
（4號標準品）
100ul的5號標準品加入100ul的標準品稀釋液

30 pg/ml
（3號標準品）
100ul的4號標準品加入100ul的標準品稀釋液

15 pg/ml
（2號標準品）
100ul的3號標準品加入100ul的標準品稀釋液

7.5 pg/ml
（1號標準品）
100ul的2號標準品加入100ul的標準品稀釋液

0 pg/ml
（空白對照）
原始濃度不用稀釋直接加入50ul。

洗滌緩沖液（50×）的稀釋：蒸餾水50倍稀釋。

操作步驟
使用前，將所有試劑充分混勻。不要使液體產(chǎn)生大量的泡沫，以免加樣時加入大量的氣泡，產(chǎn)生加樣上的誤差。
根據(jù)待測樣品數(shù)量加上標準品的數(shù)量決定所需的板條數(shù)。每個標準品和空白孔建議做復(fù)孔。每個樣品根據(jù)自己的數(shù)量來定，能使用復(fù)孔的盡量做復(fù)孔。
加入稀釋好后的標準品50ul于反應(yīng)孔、加入待測樣品50ul于反應(yīng)孔內(nèi)。立即加入50ul的*標記的抗體。蓋上膜板，輕輕振蕩混勻，37℃溫育1小時。
甩去孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30秒，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復(fù)此操作3次。如果用洗板機洗滌，洗滌次數(shù)增加一次。
每孔加入80ul的親和鏈酶素-HRP，輕輕振蕩混勻，37℃溫育30分鐘。
甩去孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30秒，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復(fù)此操作3次。如果用洗板機洗滌，洗滌次數(shù)增加一次。
每孔加入底物A、B各50ul，輕輕振蕩混勻，37℃溫育10分鐘。避免光照。
取出酶標板，迅速加入50ul終止液，加入終止液后應(yīng)立即測定結(jié)果。
在450nm波長處測定各孔的OD值。

試劑盒性能
1. 靈敏度：zui小的檢測濃度小于1號標準品。稀釋度的線性。樣品線性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù)R值為0.990。
2. 特異性：不與其它細胞因子反應(yīng)。
3. 重復(fù)性：板內(nèi)、板間變異系數(shù)均小于10%。

ELISA試劑盒結(jié) 果 判 斷 與 分 析
1、儀器值：于波長450nm的酶標儀上讀取各孔的OD值

2、以吸光度OD值為縱坐標（Y），相應(yīng)的ES標準品濃度為橫坐標（X），做得相應(yīng)的曲線，樣品的ES含量可根據(jù)其OD值由標準曲線換算出相應(yīng)的濃度。

3、檢測值范圍：0-240pg/ml

4、敏感度： 0.1 pg/ml