與噬菌體展示的多肽反應(yīng)的血清抗體的親和純化

[器材和試劑]
● 直徑為60mm的聚苯乙烯培養(yǎng)皿（Falcon 1007）
● 包被緩沖液
● 單克隆抗體（mAb）57D1。該抗體能識別M13噬菌體次要衣殼蛋白（pⅢ）N末端。它是用M13噬菌體顆粒免疫大鼠而獲得的。來自含57D1雜交瘤細(xì)胞的上清用50％（NH4）2SO4沉淀，然后在PBS中溶解并透析，后抗體在蛋白G—Sepharose上免疫純化。
● PBST
● 封閉液
● PEG—純化的噬菌體
● 細(xì)菌提取物
● PEG—純化的nRl噬菌體
● *—HCl/BSA（100mmol/L*， 用HCl調(diào)至pH 2．7， 10ug/ml BSA）
● 2mol/L Tris—HCl，pH 9．4（新鮮溶液）

[方法]
1．將4m1包被緩沖液稀釋的PEG純化噬菌體（約1×1011TU/ml）等量分加在聚苯乙烯培養(yǎng)皿中。4℃在搖床上搖動過夜。
2．棄去上清并在室溫下用PBST充分沖洗。
3．加6ml封閉液并在37℃搖床上搖動孵育1小時。
4．在總體積為4ml的封閉液中，將40ul血清與100/xl細(xì)菌提取物和4×1012pfu經(jīng)PEG純化的nRl載體噬菌體混合，并在室溫下孵育60分鐘。
5．棄去封閉液。用PBST快速洗滌。將預(yù)孵育的混合物加到平板上。4℃在搖床上搖動過夜孵育。
6．棄去溶液并在室溫下用PBST充分洗板。
7．除去洗滌緩沖液。加4ml*—HCl/BSA洗脫。室溫下?lián)u床孵育10分鐘。在含有-100ul 2mol/LTris—HCl pH 9．4的聚丙烯管內(nèi)進(jìn)行中和。
8．采用ELISA模式，用純化抗體來檢測噬菌體—多肽或抗原。