蛋白質純化親和層析法

藥品試劑：
金屬螯合親和層析膠體 （Ni-NTA agarose, QIAGEN 30210） 1 mL
◆ 在洋菜膠粒上接有nitrilotriacetic acid （NTA） 官能基，可以螯合鎳離子；使用前先以鎳離子飽和的。
Buffer B-300/0 （50 mM Na3PO4, pH 8.0; 0.3 M NaCl）
◆ 使用前才添加成10 mM β-mercaptoethanol。
Buffer B-300/20: Buffer B-300/0 加有20 mM imidazole
Buffer B-300/250: Buffer B-300/0 加有250 mM imidazole

方法步驟：
1） 親和層析膠體1 mL 已經裝填在管柱內，成為一淡藍色膠柱。請把管柱架直在鐵架上，去除下方的填塞物，用buffer B-300/0 流洗20 mL 后塞住出口，準備注入樣本。
2） 除去膠面上方的緩沖液，并取出樣本 （IEX） 使其回到室溫，慢慢用滴管加到親和膠體上，小心勿弄亂膠體表面；讓樣本沒入膠體中，同時收集流出液每管2.5 mL。
3） 待樣本全部進入膠體后，關閉出口，再慢慢加入buffer B-300/20，打開出口收集流出液；buffer B-300/20 共流洗30 mL。
4） 接著以buffer B-300/250 流洗30 mL，方法同上，收集各分劃。
5） 所有分劃均定量蛋白質并測定酶活性，收集酶活性高的數個分劃，共得 _______ mL （AF），保留100 μL 以供分析。