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    用突變的VlCDR3構(gòu)建SCFv基因文庫

    時間:2013-1-14閱讀:268
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    [方法]
    1.設(shè)計合成含有CDR3隨機化序列的VLFOR引物。當然,此引物必須以擬進行親和力成熟的抗體VL基因作為基礎(chǔ)進行設(shè)計。本例中,VLCDR3的7個氨基酸被隨機化。在每個隨機化位點中,保留了大約50%野生型氨基酸。引物設(shè)計結(jié)果如下:
    VLFOR隨機引物: 5’—CCC TCC GCC GAA CAC CCA ACC 524 513 524 524 542 541 511 CTG GCA GTA ATA ATC AGC CTC—3’
    數(shù)字對應(yīng)摩爾分數(shù)如下。
    (1)A(70%)、C(10%)、G(10%)、T(10%)。
    (2)A(10%)、C(70%)、G(10%)、T(10%)。
    (3)A(10%)、C(10%)、G(70%)、T(10%)。
    (4)A(10%)、C(10%)、G(10%)、T(70%)。
    (5)G(50%)、C(50%)。
    利用分子建模去識別哪個CDR3殘基具有溶劑可接近側(cè)鏈,來確定隨機化殘基。
    2.配制4個50w1 PCR反應(yīng)混合液,包含:
    ● 去離子水,35.5ul
    ● 20XdNTP, 2.5ul
    ● 10XVent聚合酶緩沖液,5.0ul
    ● lMB3引物(10pmol/ul),2.5ul
    ● VI-FOR引物 (10pmol/ul), 2.5ul
    ● 野生型scFv基因模板DNA(100ng), 1.0ul
    ● VentDNA聚合酶(2單位),1.0ul
    3.在有加熱蓋的熱循環(huán)儀內(nèi)加熱混合液到94℃,5分鐘。
    4.以94℃1分鐘、42℃1分鐘、72℃2分鐘的條件共循環(huán)30次,擴增VL基因。
    5.在1%瓊脂糖膠上膠純化VL基因(接近800bp);用Geneclean試劑盒提取DNA。將
    每種產(chǎn)物重懸于20ul水中。在1%瓊脂糖凝膠上與已知大小和濃度的標準對照品比較,測定DNA濃度。

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