選擇和篩選親和力更高的抗體

        選擇方法必須精心設計以便能選擇到親合力更高的抗體．而非那些在隙菌體中展示較佳、對大腸桿菌毒性較低、較為穩定或者多聚化形成而改變親和性（avidity）使得功能性親和力提高的克隆。有兩種方法可用于從低親和力或非結合性scFv本底下選擇到稀有的高親和力scFv：一種是根據結合動力學方法；另一種是根據平衡常數（Kd）的方法。無論哪種方法，很重要的是，要采用液相標記抗原而不是吸附于固相基質的抗原。使用可溶性抗原將偏向于根據結合親和力或結合動力學的選擇．而不是依據親和性（avidity）的選擇。當對scFv文庫進行選擇時．這尤為重要。因為已知有些scFv能按照一種序列依賴方式自發形成二聚體。不采用可溶性抗原可能導致選擇到二聚化scFv，而其單價結合常數并不高于野生型。甚至對于Fab模式也要采用可溶性抗原，從而避免選擇到展示了多拷貝Fab的噬菌體，后者僅有更高的功能性親和力（avidity）而已。

在基于結合動力學，也被稱為解離速率（κoff）]的選擇中，在將遠遠過量的非標記抗原加入到混合液中并維持一段特定時間之前，將首先選用飽和量的標記抗原使其與噬菌體群結果。通過確定與末標記抗原競爭的持續的時間，將允許大多數結合的野生型抗體解離，而優化的突變體卻仍然結合著，這個方法對于具有較慢解離速率的突變體的選擇是很有效的。因為V基因無論在體內或體外發生突變時，κoff下降都是一個產生高親和力的主要動力學機制。一般而言，此法可以選擇到（Kd）更佳的scFv。

我們通常傾向于平衡選擇法。在這個方法中，噬菌體與濃度低于平衡結合常數的抗原一同被孵育。它可以有效地選擇到改善平衡常數的抗體。抗原濃度下降也有助于確保選擇到高親和力scFv，而不是那些在噬菌體中表達較佳或對大腸桿菌毒性較低的抗體。使用可溶性抗原就能設置超過平衡選擇方法所需抗原濃度的對照。噬菌體可以先結合*化抗原，而后用鏈霉親和素化磁珠進行回收。可以預先估計選擇所用的適宜抗原濃度，但我們傾向于在*輪中采用幾個不同的抗原濃度。后續幾輪選擇的抗原濃度可以根據測定結合性噬菌體在產出的多克隆噬菌體中結合性噬菌體的比例來決定。用Biacore進行表面等離子共振技術（SPR）測定是為準確的。結合濃度測定是在物質運輸受限條件下進行的。另外．也可用酶聯免疫吸附試驗（ELISA）測定結合性克隆的比例。分析這些數據就可以在下一輪選擇前確定出佳抗原濃度。我們在每一輪選擇后，一般會把抗原濃度降低10～100倍。在3～5輪選擇后，就可以篩選親和力得到優化的克隆了。