如何對抗體基因序列進行多樣化

        抗體可以含有超過50個CDR殘基。因此帶來一個問題，就是選擇哪個CDR區(qū)和哪個CDR殘基進行突變。我們和其他小組的結果都顯示：定位于VH CDR3和VL CDR3的靶向突變是用噬菌體展示提高親和力的有效方法。例如，我們通過依序靶向突變VH和VL CDR3區(qū)域，可以將一種抗ErbB2抗體的親和力提高1200倍以上。與之類似，Yang等人突變了5個基因文庫中的4種CDR（VH CDRl、VL CDRl、VH CDR3和Vu CDR3）將突變相互獨立組合，可以使抗gpl20 Fab的親和力提高420倍。不過，他們也觀察到，優(yōu)化CDR3區(qū)可以使親和力提升的幅度達到大。因此，我們開始時也是選擇VH和VL CDR3區(qū)域進行突變。
當進行CDR殘基隨機化時，能有效利用序列空間的手段是將蛋白數(shù)據(jù)文庫（PDB）中同源性高的V區(qū)結構域進行分子建模；這樣可以分辨出哪些是含有溶劑可接近性側鏈的殘基，而哪些是含有隱蔽性側鏈的殘基。我們前期的試驗結果表明：對含有隱蔽性殘基的隨機化通常只會導致重新選擇野生型序列。我們也避免對*和*進行突變，因為二者在選擇后會毫無例外地恢復為野生型。*常常是CDR轉(zhuǎn)角的關鍵性殘基；*則通常是基本結構的或接觸點殘基。另外一些選擇適當CDR殘基進行突變的方法是基于對體內(nèi)親和力成熟中突變位點的研究基礎之上。再次免疫反應時，突變會頻繁集中于CDR中的一些熱點。例如，體內(nèi)中AGY所編碼的*比TCN更易突變D6]。我們用位點導向突變方法進行親和力成熟時，也觀察到類似的突變模式并建議可以針對這些熱點殘基進行靶向突變。有篇進行親和力成熟的報道，其中僅僅對VL CDR3中類似熱點進行了靶向定位突變，卻成功提高了來自很小容量抗體文庫中抗體片段的親和力。
CDR的優(yōu)化可采取平行或序貫方法進行。在CDR3平行隨機化時，將兩個CDR3分別獨立隨機化，再將單獨克隆中有利的突變合并在一起。雖然這個策略在數(shù)種抗體優(yōu)化中獲得成功，但并非所有突變都能累加。這不難理解，因為許多CDR殘基是互不兼容的。因此，我們傾向于對抗體CDR區(qū)進行序貫靶向突變。
在我們實驗室，提高抗體親和力的靶向位點突變和鏈改組（隨機突變）兩種方法都被采用。我們還用抗ErbB2單鏈Fv（VH和VL）抗體片段（scFv）對這兩種方法進行了比較。總體上，發(fā)現(xiàn)抗體中CDR3的靶向位點突變是利用噬菌體展示提高親和力更為有效的方法。不過，我們在下文對靶向位點突變和鏈改組兩種方法都進行了描述。我們實驗室專門從事scFv抗體片段研究方面的工作，因此以下實驗方案都以此模式為基礎，盡管總體原則上這些實驗方案也可被用于抗原結合性抗體片段（Fab）的成熟。