免疫印跡Z常見的非特異性條帶高本底問題

特異性背景條帶的產生是由于多克隆抗體血清中的雜抗體或是待測抗原和樣品中其他成分，具有可被抗體識別的共同表位而產生的特異性交叉反應。后者在使用單克隆抗體時較普遍。非特異性擴散的背景主要是由于印跡膜封閉得不適當或者是檢測試劑和封閉緩沖液中的某一成分發生特異性反應造成的。
（1）應對背景彌散的策略
1）若用間接檢測技術，首先應考慮二抗是否與背景有關。觀察省去一抗時二抗單獨作用所產生的背景。若背景由二抗產生的，可采用以下措施：①縮短二抗的孵育時間；②試用高濃度的蛋白質來吸附二抗。首先在二抗試劑內加入3％BSA。若背景仍然存在，再試用抗原制品的原液（用丙酮臟粉較好）；③使用替代的二抗。
2）使用不同的封閉緩沖液。
3）若無別的選擇，可嘗試用5％脫脂奶粉／吐溫。
4）滴定一抗和／或二抗的效價，找到一個產生的信號強度可以接受的較低濃度。
5）縮短一抗和二抗的孵育時間。
6）每一步都用RIPA緩沖液（1％NP40、0．5％DOC、0．1％SDS、150mmol／L NaC1和50mmol／LTris，pH8．0）沖洗印跡膜。
7）在一抗和二抗試劑中加入1％NP-40或0．3％吐溫和3％BSA。
8）延長每次清洗時間。
（2）應對特異性背景條帶的策略
1）若用間接檢測技術，首先應考慮二抗是否與背景有關。觀察省去一抗時二抗單獨作用所產生的背景。若背景條帶是由二抗產生的，首先使用替代的標記試劑。其次，試用抗原制品原液吸附二抗。丙酮粉較為適合。
2）若使用單抗，可改用另一種單抗。但必須注意，若同一條帶持續存在，說明待測抗原和其他條帶之間存在氨基酸的同源性。
3）若使用多克隆抗血清作為一抗，可試用不含待測抗原的蛋白質制品吸附血清。

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