DNA為基礎(chǔ)的方法檢測(cè)飼料中的動(dòng)物源性成分

 

    核酸探針雜交方法的原理是堿基配對(duì)，即一條DNA鏈能與它的特異互補(bǔ)鏈配對(duì)形成雙鏈DNA。因此，用一個(gè)熒光物質(zhì)或放射性物質(zhì)標(biāo)記的單鏈核苷酸探針能夠很快地從許多其他DNA分子的混合物中檢測(cè)出它的互補(bǔ)單鏈。由于雜交探針需要用熒光物質(zhì)或放射性物質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記，所以該法在實(shí)際檢測(cè)中很少應(yīng)用。

 

    動(dòng)物基因組中存在大量的分散重復(fù)序列（interspersedrepeat sequence，IRS），并且是種間高度特異的，DNA指紋分析就是通過用哺乳動(dòng)物中廣泛存在的分散重復(fù)序列的特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，建立從牛到鴕鳥的30多種哺乳動(dòng)物的DNA指紋圖譜，來對(duì)飼料中的動(dòng)物源性成分的DNA進(jìn)行鑒定。由于DNA指紋有一定難度，所以該法在實(shí)際檢測(cè)中也較少應(yīng)用。

 

    PCRRFLP（限制性內(nèi)切酶多態(tài)性分析）方法是用引物進(jìn)行擴(kuò)增，然后對(duì)擴(kuò)增片段用限制性內(nèi)切進(jìn)行酶切，利用限制性內(nèi)切酶的多態(tài)性進(jìn)行檢測(cè)。由于使用的限制性內(nèi)切酶對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行限制性內(nèi)切酶切分析不方便，所以該法在實(shí)際檢測(cè)中應(yīng)用較少。

 

    PCR特異擴(kuò)增方法由于其簡(jiǎn)單、快速、特異性強(qiáng)成為目前廣泛應(yīng)用的方法，特別是熒光PCR（或稱為Real-timePCR）的應(yīng)用使得檢測(cè)的特異性和敏感性更高。Tartaglia*次設(shè)計(jì)了PCR試驗(yàn)，將其用于肉骨粉以及飼料中的反芻動(dòng)物源性成分的檢測(cè)。他所選的目標(biāo)片斷是線粒體DNA中編碼tRNAlys和ATP合成酶8亞基和6亞基的片段，高等植物中未發(fā)現(xiàn)其同源序列，采用異硫氰酸胍和二氧化硅方法提取DNA，肉骨粉的檢出的含量的低限為0．125％，我國(guó)的出入境檢驗(yàn)檢疫系統(tǒng)根據(jù)該方法制定了檢測(cè)肉骨粉中牛源性、羊源性成分的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。

 

    但是，隨后對(duì)PCR方法的驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)這一方法有其缺陷，因?yàn)榧庸み^程中的熱處理使得大量DNA被嚴(yán)重降解，分解成小片段，有數(shù)據(jù)表明當(dāng)肉被加熱到100~C時(shí)，其中的DNA就被降解到1100bp至300bp左右。若設(shè)計(jì)的目的片段太長(zhǎng)則可能無法擴(kuò)增出來，這在許多人的報(bào)道中被證實(shí)。因此，需要設(shè)計(jì)比較小的目的片段，同時(shí)要選擇細(xì)胞內(nèi)含量比較多的目標(biāo)片段。目前所建立的PCR方法中以線粒體DNA中的細(xì)胞色素b與tRNAlysATP合成酶亞基8和亞基6的片段為目標(biāo)區(qū)域的較多，線粒體基因的其他部分（如D—loop區(qū)域），還有其他核酸序列（如衛(wèi)星DNA、actln基因、SINEs序列和LINEs序列、生長(zhǎng)素基因等）也被作為檢測(cè)的目的基因。

 

    線粒體編碼的長(zhǎng)度為60-70bp的片段已經(jīng)被作為一些物種的目標(biāo)片段進(jìn)行檢測(cè)，由于這些片段比較小，用瓊脂糖電泳檢測(cè)非常不方便，但用熒光PCR檢測(cè)可以避免這些問題。Real—tmmPCR中使用的TaqMan技術(shù)是在引物的基礎(chǔ)上又添加了一條探針，只有在探針與擴(kuò)增出的目標(biāo)片段結(jié)合時(shí)，才發(fā)出熒光信號(hào)，可以根據(jù)發(fā)出的熒光對(duì)反應(yīng)進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)，比經(jīng)典的PCR方法特異性高，這是因?yàn)橛幸锖吞结槍?duì)目標(biāo)進(jìn)行雙重篩選。有資料表明用這項(xiàng)技術(shù)對(duì)幾種動(dòng)物成分進(jìn)行了檢測(cè)，在所有樣品中動(dòng)物的成分都可清楚地檢測(cè)到，這一結(jié)果說明，肉骨粉經(jīng)過加工后，即使溫度達(dá)到141~C，也有足夠的DNA可通過Real—time PCR技術(shù)檢測(cè)到，而當(dāng)目標(biāo)片段設(shè)計(jì)為275bp或350bp時(shí)，所有的樣品都檢測(cè)不到。同時(shí)對(duì)于目前的定性檢測(cè)，利用不同的探針和染料可以做到一個(gè)反應(yīng)內(nèi)檢測(cè)多個(gè)動(dòng)物品種。

 

    PCR方法在檢測(cè)大多數(shù)生產(chǎn)條件下生產(chǎn)的飼料，至少在歐盟法定的條件下生產(chǎn)的肉骨粉是有效的，但生產(chǎn)過程的多樣性導(dǎo)致了基因物質(zhì)的不同降解水平，因此不同的生產(chǎn)條件都會(huì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生影響，擴(kuò)增的片段大小也會(huì)對(duì)檢測(cè)的靈敏度產(chǎn)生影響。PCR的缺點(diǎn)還表現(xiàn)在必須的刻防止交叉污染，并且這個(gè)方法無法檢測(cè)動(dòng)物DNA的來源，因?yàn)槿夤欠鄣某霈F(xiàn)與陽(yáng)性信號(hào)的出現(xiàn)并無直接關(guān)系，乳汁、血液、脂肪都有可能是DNA的來源。PCR方法相對(duì)來說是一種比較昂貴的方法，不僅試劑貴而且也需要比較昂貴的儀器，特別是熒光PCR儀。