瓊脂糖凝膠電泳技術 瓊脂糖凝膠電泳

 [目的要求]
        通過本實驗學習瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的方法和技術
[實驗原理]
       瓊脂糖凝膠電泳是分離鑒定和純化DNA片段的常用方法。DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動時有電荷效應和分子篩效應，DNA分子在高于等電點的pH溶液中帶負電荷，在電場中向正極移動。由于糖磷酸骨架在結構上的重復性質，相同數量的雙鏈DNA幾乎具有等量的凈電荷，因此它們能以同樣的速度向正極方向移動。不同濃度瓊脂糖凝膠可以分離從200bp至50kb的DNA片段。在瓊脂糖溶液中加入低濃度的溴化乙錠（ethidum  bromide ,EB），在紫外光下可以檢出 10ng的DNA條帶，在電場中，pH8.0條件下，凝膠中帶負電荷的DNA向陽極遷移。
    瓊脂糖凝膠有如下特點：
   (1) DNA的分子大小  在凝膠基質中其遷移速率與堿基對數目的常用對數值成反比，分子越大遷移得越慢。
 (2) 瓊脂糖濃度     一個特定大小的線形DNA分子,其遷移速度在不同濃度的瓊脂糖凝膠中各不相同。DNA電泳遷移率(u)的對數與凝膠濃度(t)成線性關系。
   (3) 電壓     低電壓時，線狀DNA片段遷移速率與所加電壓成正比。但是隨著電場強度的增加，不同分子量DNA片段的遷移率將以不同的幅度增長，隨著電壓的增加，瓊脂糖凝膠的有效分離范圍將縮小。要使大于2kb的DNA片段的分辨率達到大，所加電壓不得超過5v/cm。
   (4) 電泳溫度   DNA在瓊脂糖凝膠電泳中的電泳行為受電泳時的溫度影響不明顯，不同大小的DNA片段其相對遷移速率在4℃與30℃之間不發生明顯改變，但濃度低于0.5%的凝膠或低熔點凝膠較為脆弱，在4℃條件下電泳。
   (5) 嵌入染料  熒光染料溴化乙錠用于檢測瓊脂糖凝膠中的DNA，染料嵌入到堆積的堿基對間并拉長線狀和帶缺口的環狀DNA,使其剛性更強,還會使線狀遷移率降低15%。
   (6) 離子強度  電泳緩沖液的組成及其離子強度影響DNA電泳遷移率。在沒有離子存在時（如誤用蒸餾水配制凝膠，電導率小，DNA幾乎不移動，在高離子強度的緩沖液中（如誤加10×電泳緩沖液），則電導很高并明顯產熱，嚴重時會引起凝膠熔化。
       對于天然的雙鏈，常用的幾種電泳緩沖液有TAE、TBE等，一般配制成濃縮母液，室溫保存，用時稀釋。
[實驗儀器與設備]
     1. 恒溫培養箱                   2. 瓊脂糖凝膠電泳系統
     3. 高壓滅菌鍋                    4. 紫外線透射儀
[實驗材料]
     1.三羥甲基氨基甲烷（Tris）      2.硼酸
     3.乙二胺四乙酸(EDTA)              4.溴酚藍
     5.蔗糖                                         6.瓊脂糖
     7.溴化乙錠                                  8.DNA marker
     9.DNA樣品
[實驗步驟]
1.緩沖液的配制

• 5×TBE(5倍體積的TBE貯存液)

   配1000ml 5×TBE:
Tris                      54g
硼酸                    27.5g
0.5mol/l EDTA    20ml
Ph8.0

• 凝膠加樣緩沖液(6×)

溴酚藍            0.25%
蔗糖                40%
③溴化乙錠溶液(EB)     0.5μg/ml
2.制備瓊脂糖凝膠
  按照被分離DNA的大小,決定凝膠中瓊脂糖的百分含量。可參照下表：
          瓊脂糖凝膠濃度           線性DNA的有效分離范圍
                0.3%                         5-60   kb
                0.6%                         1-20   kb
                0.7%                         0.8-10 kb
                0.9%                         0.5-7  kb
                1.2%                         0.4-6  kb
                1.5%                         0.2-4  kb
                2.0%                         0.1-3  kb

3.膠板的制備
    (1) 用高壓滅菌指示紙帶將洗靜、干燥的玻璃板的邊緣（或電泳裝置所皿備的塑料盤的開口）封住，形成一個膠膜（將膠膜放在工作臺的水平位置上，用水平儀校正）。
    (2) 配制足夠用于灌滿電泳槽和制備凝膠所需的電泳緩沖液（1×TBE）。準確稱量的瓊脂糖粉。緩沖液不宜超過錐瓶或玻璃瓶的50%容量。 在電泳槽和凝膠中務必使用同一批次的電泳緩沖液，離子強度或pH值的微小差異會在凝膠中形成前沿，從而大大影響DNA片段的遷移率 。
    (3) 在錐瓶的瓶頸上松松地包上一層厚紙。如用玻璃瓶，瓶蓋須擰松。在沸水浴或微波爐中將懸浮加熱至瓊脂糖溶解。注意：瓊脂糖溶液若在微波爐里加熱過長時間，溶液將過熱并暴沸。應核對溶液的體積在煮沸過程中是否由于蒸發而減少，必要時用緩沖液補充。                                                                                     
    (4) 使溶液冷卻至60℃。加入溴化乙錠（用水配制成10mg/ml的貯存液）到終濃度為0.5ug/ml，充分混勻。
    (5) 用移液器吸取少量瓊脂糖溶液封固膠模邊緣，凝固后，在距離底板0.5-10mm的位置上放置梳子，以便加入瓊脂糖后可以形成完好的加樣孔。如果梳子距玻璃板太近，則拔出梳子時孔底將有破裂的危險，破裂后會使樣品從玻璃板之間滲透。
    (6)將剩余的溫熱瓊脂糖溶液倒入膠模中。凝膠的厚度在3-5mm之間。檢查一下梳子的齒下或齒間是否有氣泡。
    (7)在凝膠*凝固后（于室溫放置30-45分鐘） ，小心移去梳子和高壓滅菌紙帶，將凝膠放入電泳槽中。
    低熔點瓊脂糖凝膠及濃度低于0.5%的瓊脂糖凝膠應冷卻至4℃，并在冷庫中電泳。
 (8)加入恰好沒過膠面約1mm深的足量電泳緩沖液。
4．加樣
    DNA樣品與所需加樣緩沖液混合后，用微量移液器，慢慢將混合物加至樣品槽中。此時凝膠已浸沒在緩沖液中。 一個加樣孔的大加樣量依據DNA的數量及大小而定，一般為20-30μl樣品。
已知大小的DNA標準，應同時加在凝膠的左凝膠的左側和右側孔內。確定未知DNA的大小。測量未知DNA的大小時，要所有樣品都用相同的樣品緩沖液。
5．電泳
    在低電壓條件下,線形DNA片段的遷移速度與電壓成比例關系,但是,在電場增加時,不同相對分子質量的DNA片段泳動度的增加是有差別的。因此，隨著電壓的增加，瓊脂糖凝膠的有效分離范圍隨之減小。為了獲得電泳分離DNA片段的大分辨率，電場強度不應高于5V/cm。當溴酚藍指示劑移到到距離膠板下沿約1-2cm處，停止電泳。
[作業]
       1．  在波長為254nm的紫外燈下,觀察染色后的電泳凝膠。
2．  采用透射紫外光拍照，照相機鏡頭加近攝光圈和紅色濾光片（580-600n m）,距離50-60cm。采用全色膠卷，5.6光圈,10-20S。（或采用凝膠成像系統，將圖片以文件的形式保存）