當尋找適用的方法時，請注意下述資料是10多年經驗的結晶。
制備1升Bouin固定液：2g苦味酸溶于500ml去離子水中，濾過，在通風櫥中，加入20g多聚甲醛，加熱至60℃，加數滴lmol／LNaOH使其溶解；冷卻，加500ml 2xPBS。
大多數的組織學研究都采用多聚甲醛固定、石蠟包埋的組織標本。因此，此類來源的大多數的組織和器官，對抗原的定位可直接提供可靠的資料。組織學家和病理學家有豐富的組織學經驗，并且，對抗原表達模式的評價是很有價值的。
如果固定和包埋過程粗糙，則許多抗原不能被很好地保存。固定的持續時間是一個很重要的可變因素，因為延長固定時間會降低抗體反應能力。在病理學實驗室，固定的持續時間和其他細節也很少規范化。因為固定液對組織的穿透率在特定溫度下是恒定的（大約室溫下imm／h），所以，不可能將所有樣品用相同的方式固定。因免疫染色的目的不同，固定方法應各異。理想的設計是研究者能夠將標本的收集、固定專門化，在研究中優化設計，從而能夠更好地證實抗原。
避免使用含有汞的固定液。
1．準備工作
石蠟組織塊可以事先準備，切片可以在步驟5中完成。許多病理學或其他相關實驗室有大量貯存的研究材料。
2．需要的溶液和特殊設備
4％多聚甲醛（新鮮配制，見附錄Ⅳ）或Bouin固定液，詳見步驟2；
二甲苯、100％乙醇和95％乙醇；
切片機，石蠟包埋設備。
3．操作步驟
（1）將組織切成小塊約lcm×lcm×0．4cm。
Methocarn是甲醇：氯仿：冰乙酸按6：3：1的比例配制的混合物。當使用Methocarn時，切片的*步必須使用無水乙醇。
（2）將組織塊放入固定液中，如果標本制備專為進行免疫化學定位研究，包括直接染色或者對比染色、復染，建議使用新鮮配制的4％多聚甲醛。然而，標準的病理學方法可以有效地使用任何一種廣泛適用的固定液，包括Bouin液或Methocarn。
固定液穿透組織大約每小時imm。可以由此估計判定所需要的固定時間。
（3）標本孵育2h至過夜。
（4）標準的石蠟包埋過程和組織切片。
（5）收集4um切片，粘于干凈的載玻片上。
石蠟組織塊在步驟4常可貯存，供以后檢測。石蠟組織塊較穩定，可以使用多年。
（6）標本片于37℃孵育過夜。
高溫（步驟6）常常在許多組織化學過程中被采用，但是常會引起許多抗原表位的缺失，所以應盡可能避免。
（7）切片用二甲苯脫蠟，換2次，每次3min。
（8）用系列乙醇水化（100％乙醇，換2次，每次3min；95％乙醇，換2次，每次3min。
（9）用水漂洗。
由于固定、包埋和準備條件粗糙，石蠟包埋組織切片的染色常要求敏感的檢測方法和應用多步驟放大效應技術。
此時，標本可進行抗體染色
4．常見的問題
如果使用過氧化物酶或者堿性磷酸酶標記的檢測方法，在加入抗體前如果需要阻斷內源性酶的活性，則標本應該先阻斷或抑制內源性酶的活性。由于阻斷過程也許會損傷一些抗原，所以不如改用檢測試劑。
阻斷內源性過氧化物酶的活性，使用甲醇：3％過氧化氫（按4：1的比例配制）溶液孵育標本20min。過氧化氫一般以30％的溶液貯存于4℃，可以存放1個月。有些標本如睥或骨髓具有較高過氧化氫酶活性，則采用0．1％鹽酸苯肼／PBS溶液會取得較好的效果。盡管有些資料建議單純使用3％過氧化氫處理標本，但是不應該這樣做，因為劇烈的反應和氣泡的形成可以破壞標本。
阻斷內源性堿性磷酸酶活性，則用0．1 mm01／L左旋咪唑溶液孵育。此抑制劑不能減少腸組織的堿性磷酸酶活性。因此，堿性磷酸酶標記的抗體不宜用于有內源性腸堿性磷酸酶的標本染色。
