克倫特羅酶聯免疫定量檢測試劑盒使用說明書
概述:
克倫特羅（Clenbuterol）屬于一類β-興奮劑，具有改進脂肪型動物體內肉與脂肪的比例的作用，亦可促進動物生長。但同時，此藥物還會使非橫紋肌松弛，人體攝入后可引起心跳、心率不正常等副反應，甚至可導致心臟病。因此在我國，克倫特羅在畜牧業上的使用是被嚴格禁止的。
本試劑盒利用競爭酶聯免疫法對生物樣品中的克倫特羅進行定量分析。適用于動物尿液、血清、內臟等物質中克倫特羅的快速檢測。由于ELISA法的高通量與簡便快速，適合大量樣本的定量篩查，自樣本加入至結果讀出，不超過60分鐘，檢測靈敏度為0.1ppb。
一、 簡要原理
試劑盒所提供的微孔板上包被有抗體，然后將校準品或樣本中的克倫特羅與酶標記的克倫特羅加入微孔中后，兩者可競爭結合克倫特羅抗體，洗去未結合的酶標記克倫特羅。加入底物后，在酶作用下，底物溶液會顯藍色，加入終止劑后，溶液由藍轉為金黃色。在450nm波長光下測吸光度，吸光度高低與校準品或樣品中克倫特羅的含量呈反比，根據校準品的讀數作出校準曲線，并利用校準曲線計算出樣品中克倫特羅的含量。
二、 試劑盒組成
1. 酶標反應板： 96孔易折板，抗體已包被
2. 克倫特羅校準品： 1ml/瓶×6瓶 濃度：0ppb、0.1ppb、0.3ppb、0.9ppb、2.7ppb、8.1ppb
3. 11×酶標記克倫特羅濃縮液： 1.2ml/瓶×1瓶（稀釋11倍使用）
4. 底物液： 11ml/瓶×1瓶
5. 酶標稀釋液： 20ml/瓶×1瓶
6. 50×濃縮洗滌液： 20ml/瓶×1瓶（稀釋50倍使用）
7. 終止劑： 11ml/瓶×1瓶
8. 其他： 說明書×1份 自封袋×1個
2-8℃貯存，有效期一年
三、 實驗需要但試劑盒不提供的試劑和儀器
1. 試劑
――――――10mM鹽酸溶液
――――――氯化鈉
――――――50mM PH7.0 PBS （配制:9g NaCl；4.65g Na2HPO4·12H2O；0.56g NaH2PO4·2H2O 溶解于1000ml蒸餾水中）
――――――異丙醇
――――――乙酸乙酯
2 .儀器
――――――微孔板酶標儀
――――――渦旋振蕩器或超聲波粉碎儀
――――――離心機
――――――20μl、200μl、1ml移液器
――――――氮吹儀或旋轉蒸發儀
四、 待測樣品處理方法
1. 尿液
新鮮尿液可直接測定，如尿液混濁，則離心取上清進行檢測。（如尿液中克倫特羅含量超出試劑盒線性范圍,可用蒸餾水或50mM PH7.0的PBS對尿液進行適當稀釋后再行檢測）
2. 肉樣及內臟組織
1）.稱取肌肉或內臟樣本10g，用20ml 10mM鹽酸溶液勻漿，置于離心管中，充分振蕩混勻5min或超聲混勻5min,再靜置10分鐘。之后10000rpm離心10min或4500rpm離心20min（離心溫度保持在10℃左右）。收集澄清的上清液（注意勿吸取脂肪層），可直接用于檢測。（相當于0.5g樣品/ml）
2）.若要獲得更高的檢測靈敏度，可在離心后收集所有上清，加入氯化鈉固體至0.32g/ml，可能會有沉淀或乳化現象產生，請勿離心!將2ml上清轉移至玻璃離心管中，加入4ml異丙醇+乙酸乙酯（2+3），充分振蕩混勻5分鐘,靜置15分鐘。提取完畢，3000r/min離心10min，將2ml上層有機相轉移至玻璃試管中，用氮吹儀60℃吹干有機相，然后加入一定量的蒸餾水或 50mM PH7.0的PBS溶液將殘留物溶解，待檢（若復溶體積為0.5ml,則相當于1g樣品/ml）
3. 動物飼料
稱取5.0g研碎的飼料樣品，加入10ml 5mM HCL，置于離心管中充分振蕩混勻5min或超聲混勻5min，再靜置10分鐘。之后10000rpm離心10min或4500rpm離心20min（離心溫度保持在10℃左右），轉移出上清液，可直接用于檢測。
若要獲得更高的檢測靈敏度，可按“肉樣及內臟組織”處理方法2）.中所述進行處理。（如*按前述處理,則復溶體積為0.5ml時，相當于1g樣品/ml）
五、 試劑準備
1. 實驗前準備
將試劑盒取出，室溫（20-25℃）放置30分鐘，使試劑盒回溫。
2. 酶標記克倫特羅工作液準備
由于稀釋后的酶標記克倫特羅工作液穩定性較差，所以請從試劑盒中取出所需量的酶標記克倫特羅濃縮液，用酶標稀釋液以1:11的比例稀釋濃縮酶標記液（例如80μl濃縮液+800μl樣品稀釋液）。
3. 洗滌液配制
取出所需量的濃縮洗滌液，加入49倍體積的蒸餾水，即成洗滌工作液（例如10ml濃縮液+490ml蒸餾水）
六、 操作步驟
1. 從錫箔袋中取出所需的微孔板條，將暫時不用的微孔板條放回帶有干燥劑的錫箔袋中，并用試劑盒附帶的自封袋封存。
2. 在一個微孔中加入150μl蒸餾水作為空白對照。
3. 其余各微孔中加入50μl克倫特羅校準液或已完成前處理的待測樣品。
注意：加入校準液順序為按照濃度從低到高加入，以避免校準液濃度出現偏差。
4. 每孔（除空白對照孔以外）加入100μl酶標記克倫特羅工作液（配制方法見五-2）
注意：在試劑加入過程中，請避免移液器滴頭接觸已加入的校準液或待測樣品，防止孔間交叉污染；避免在加樣過程中產生氣泡。
5. 振蕩混勻反應液，于20-25℃環境下放置30分鐘（建議使用25℃恒溫箱）。
6. 取出微孔板，傾空液體，每孔加入400μl洗滌液，輕輕振蕩，靜置片刻，傾去洗滌液，重復4次。zui后在吸水紙上將微孔板拍干。
7. 每孔加入100μl的底物液，20-25℃避光環境下放置20分鐘（建議使用25℃恒溫箱）。
8. 取出微孔板，每孔加入100μl反應終止液，充分混勻（微孔中切忌存在氣泡），用酶標儀在450nm下讀數，扣除空白，并繪制校準曲線。
七、 結果判定
1. 樣本中的克倫特羅含量可以通過在半對數坐標紙木上手工繪制校準曲線來進行定量計算；或者應用合適的計算繪圖軟件繪制出校準曲線，得出公式，并計算樣品中的克倫特羅濃度。
2. 先將除空白孔外的所有測定孔扣除空白對照的吸光度。然后將扣除空白后的校準品孔吸光度值 （B） 除以扣除空白后的陰性對照孔吸光度值 （B0） ，再乘以，即：
以所對應的校準品濃度為橫坐標（x），繪制出校準曲線。
3. 用上述方法，同樣地得出對于樣本測定孔的y值，代入校準曲線，即可計算出相應樣本的克倫特羅濃度值。以下為校準曲線的一個示意圖：
八、 試劑盒相關方法學數據
1. 試劑盒靈敏度
本試劑盒靈敏度為0.1ppb
2. 試劑盒半抑制率
本試劑盒半抑制率約在0.7～1.0ppb左右
3. 試劑盒的重復性
對不同濃度的校準品進行8次重復測定，獲得每個濃度所對應的OD450值，計算變異系數，結果如下：
4. 試劑盒線性范圍
本試劑盒在0.2ppb～4ppb區間呈線性相關。
5. 添加回收實驗的回收率
以豬尿為例，回收率在80～120%之間。
6. 交叉反應
結構類似物 交叉反應率
* 3.5%
特普他林 1.2%
異丙基腎上腺素 <0.1%
九、 實驗中注意事項
1. 在試驗前將所有試劑預熱至室溫。
2. 試劑加入各微孔的時間差越小越好，如果檢測樣本較多，建議使用多孔移液器。
3. 操作過程中手盡量少接觸酶標板底部，并且在讀數前用軟紙輕輕擦去底部可能附著的水珠或指痕。
4. 在加入反應終止液后1小時內讀數。
5. 本實驗可采用單孔或平行雙孔定量測定，但雙孔定量更準。
6. 反應終止液為強酸物質，避免接觸皮膚或衣物。
7. 不要使用過期試劑，不要將不同批號試劑混用，否則會造成靈敏度降低。
