熒光素標(biāo)記物質(zhì)種類

DyLight 594是一種橙紅色熒光團(tuán)，其zui大吸收波長在593nm，相應(yīng)的zui大發(fā)射波長是618nm。DyLight熒光染料是通過將磺酸酯加成到香豆素、呫噸類 （如FITC和羅丹明）以及花箐素類熒光染劑上而成，磺酸酯使DyLight帶負(fù)電荷并呈親水性。與傳統(tǒng)的熒光團(tuán)，如FITC、羅丹明以及Cy3和Cy5 等相比，DyLight熒光染料具有較寬的激發(fā)和發(fā)射波段，幾乎覆蓋了所有的可見光區(qū)域，包括藍(lán)色、綠色、黃色、橙色、紅色，以及近紅外和遠(yuǎn)紅外波段，因 此可用于大部分熒光顯微鏡以及遠(yuǎn)紅外成像系統(tǒng)。并且與傳統(tǒng)的熒光團(tuán)相比，具有發(fā)光亮度更強(qiáng)，靈敏度更高，背景更低的優(yōu)勢(shì)，同時(shí)其對(duì)pH的穩(wěn)定性更好，發(fā)光 也更持久，因此更適合于拍照。DyLight熒光熒光染料作為熒光顯微鏡、細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)內(nèi)的生物分子、細(xì)胞和組織標(biāo)記物，可應(yīng)用于生物技術(shù)和研 究等眾多領(lǐng)域。

Cy2耦聯(lián)基團(tuán)激發(fā)波長為492nm，發(fā)光為波長510nm的綠色可見光。Cy2和FITC使用相同的濾波片，但是要避免使用含有磷酸化的苯二胺的封片劑，因?yàn)檫@種抗淬滅劑和Cy2反應(yīng)，在染色片儲(chǔ)存后會(huì)導(dǎo)致熒光微弱和擴(kuò)散。Cy2屬于花菁類染料 （Cyanine Dyes），常見的Cy系列染料主要包括有Cy2、Cy3、Cy5等，能與細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)結(jié)合。這類染料的熒光特性與傳統(tǒng)熒光素類似，但水溶性和對(duì)光穩(wěn)定性較強(qiáng)，熒光量子產(chǎn)率較高，對(duì)pH等環(huán)境不敏感。常用于多重染色。與FITC相比，Cy2的熒光強(qiáng)度更大，光穩(wěn)定性和抗萃滅性更好。

FITC（Fluorescein Isothiocyanate，異硫氰酸熒光素）純品為黃色或橙黃色結(jié)晶粉末，易溶于水和酒精溶劑。FITC分子量為389.4，zui大吸收光波長為 490～495nm，zui大發(fā)射光波長為520～530nm，呈現(xiàn)明亮的黃綠色熒光。FITC在冷暗干燥處可保存多年，是目前應(yīng)用zui廣泛的熒光素。由于 FITC是小分子化合物，每一個(gè)抗體可標(biāo)記幾個(gè)FITC分子，IgM通常用小分子的熒光素標(biāo)記，如FITC、Cy3/5、Texas Red等。然而FITC的zui大缺點(diǎn)是淬滅快，因此要和抗淬滅劑一起使用。FITC性質(zhì)穩(wěn)定，能與蛋白質(zhì)結(jié)合，是檢測組織細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)zui常用的熒光探針。它 還能標(biāo)記抗體，可用于免疫組織化學(xué)單染或多重染色。FITC熒光二抗主要優(yōu)點(diǎn)是人眼對(duì)黃綠色較為敏感，通常切片標(biāo)本中的綠色熒光少于紅色。缺點(diǎn)是在光照下 易淬滅，易受自發(fā)熒光影響。

Cy5zui大激發(fā)光波長為649nm，zui大發(fā)射光波長為680nm，呈紅色熒光。Cy5屬于花菁類染料（Cyanine Dyes），常見的Cy系列染料主要包括有Cy2、Cy3、Cy5等，能與細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)結(jié)合。這類染料的熒光特性與傳統(tǒng)熒光素類似，但水溶性和對(duì)光穩(wěn)定性較強(qiáng)，熒光量子產(chǎn)率較高，對(duì)pH等環(huán)境不敏感。常用于多重染色。Cy3可以和熒光素一起作雙標(biāo)。Cy3還可以和Cy5一起在共聚焦顯微鏡實(shí)驗(yàn)中作多標(biāo)記。Cy3和Cy5比其他的熒光團(tuán)探針要更亮，更穩(wěn)定，背景更弱。由于Cy5的zui大發(fā)射波長為680nm，很難用裸眼觀察，而且不能使用高壓汞燈作為理想的激發(fā)光源，因此，使用普通熒光顯微鏡時(shí)，不推薦使用Cy5。通常觀察Cy5時(shí)需使用激光掃描共聚焦顯微鏡。

TRITC（Tetramethyl Rhodamin Isothiocyanate，四甲基異硫氰酸羅丹明）是羅丹明的一種衍生物之一，呈紫紅色粉末，較穩(wěn)定。羅丹明的衍生物還包括Rhodamine Red-X（RRX）, Texas Red（TR）等。這些羅丹明衍生物的耦聯(lián)基團(tuán)具有不同的吸收波長 （550, 570, 596nm）和zui大發(fā)射波長（570, 590, 620nm）。TRITC熒光素能與細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)結(jié)合，比FITC穩(wěn)定性好，在生理?xiàng)l件下對(duì)pH值變化不敏感，熒光強(qiáng)度受自發(fā)熒光干擾小。TRITC的zui 大激發(fā)光波長為550nm，zui大發(fā)射光波長為620nm，呈橙紅色熒光，與FITC發(fā)出的黃綠色熒光對(duì)比鮮明，常用于免疫熒光組織化學(xué)雙重染色。因其熒光 淬滅慢，也可用于單獨(dú)標(biāo)記染色。需要注意的是，因?yàn)镕ITC和PE可以被氬燈的488nm波長激發(fā), 在流式細(xì)胞儀中用FITC作雙標(biāo)，另一種用藻紅蛋白（PE）耦聯(lián)基團(tuán)要比羅丹明好。