放射免疫分析法原理及操作注意事項

放射免疫分析的原理：就是利用放射性核素標(biāo)記抗原或抗體，然后與被測的抗體或抗原結(jié)合，形成抗原抗體復(fù)合物的原理來進行分析的。它又分為兩種方法。

一、競爭性RIA，又稱傳統(tǒng)RIA

主要特點：標(biāo)記的是抗原。其原理：未知抗原Ag+標(biāo)記抗原Ag +已知定量抗體Ab標(biāo)記抗原與抗體復(fù)合物AgAb+未知抗原與抗體復(fù)合物Ag Ab+游離標(biāo)記抗原Ag （去除）（未知抗原多，標(biāo)記抗原與定量抗體結(jié)合的復(fù)合物就少，表現(xiàn)為負相關(guān)）。

臨床上甲胎蛋白（AFP），癌胚抗原（CEA），8 一微球蛋白（pz—MG ），鐵蛋白（Fer），*p亞單位（HCG-13）等的檢測都是競爭性RIA法原理。競爭性RIA法，根據(jù)加樣順序與溫育次數(shù)的區(qū)別，反應(yīng)方式分三種：平衡法，將非標(biāo)記抗原（被測物與標(biāo)準(zhǔn)品）、抗體、標(biāo)記抗原依次加入反應(yīng)管，混勻后一次性溫育至反應(yīng)達到動態(tài)平衡，再加分離劑分離B（復(fù)合物）與F（游離物）如：AFP，8 一MG，F(xiàn)er；順序加樣法，先將非標(biāo)記抗原（被測物與標(biāo)準(zhǔn)品），與抗體在反應(yīng)管內(nèi)作*次溫育，待反應(yīng)達到動態(tài)平衡后。加入標(biāo)記抗原，再作第二次溫育后，分離B與F如：CEA；急診檢測法：為臨床急需檢測結(jié)果而提出的反應(yīng)方式，不等RIA 反應(yīng)達到動態(tài)平衡就終止反應(yīng)；分離劑的選擇有，PEG（聚乙二醇），第二抗體等。

現(xiàn)在一般采用的是：第二抗體與PEG合用的方法，稱為雙抗體一PEG法。

PEG原理：PEG濃度達到7 一9 時能使抗原一抗體復(fù)合物沉淀。

優(yōu)點：經(jīng)濟，簡便，通用。

缺點：重復(fù)性差，非特異性結(jié)合率高。

第二抗體：*抗體是可與被測抗原進行特異結(jié)合的抗體，來自家兔或豚鼠。用*抗體為抗原，作用到羊，馬身上，產(chǎn)生的抗*抗體的抗體稱第二抗體。第二抗體與*抗體在適當(dāng)條件下發(fā)生特異性結(jié)合，生成分子量很大的免疫復(fù)合物（AgAb ×Ab ），能自然沉淀。

優(yōu)點：分離效果好。非特異性結(jié)合率低。

缺點：增加經(jīng)費投入。需要第二次溫育，延長了時間。

所以就產(chǎn)生了兩者合用的雙抗體一PEG法，它結(jié)合了上述兩種方法的優(yōu)點。

二、非競爭性RIA，又稱免疫放射分析（IRMA）

主要特點：標(biāo)記的是抗體。

按反應(yīng)原理分為兩種：

（一）單位點IRMA

其原理：抗原只有一個抗原決定簇，所測的抗原為小分子抗原，Ab+AgAg Ab+ Ab+ ImAd—Ag ImAd—AgAb+Ag Ab（去除）（負相關(guān)）：（ImAd—Ag）固相抗原免疫吸附劑，一般用聚苯乙烯塑料珠包被抗原；雙位點IRMA：抗原有兩個抗原決定簇，所使用的兩種亞型抗體在與同一抗原分子結(jié)合時互不干擾ImAd—Ab+AgImAd—Ab—Ag+ AbImAd-Ab—Ag- Ab+ Ab（過剩的，游離的）：（ImAd—Ab）固相抗體免疫吸附劑，一般用聚苯乙烯塑料珠包被抗體。

（二）雙位點IRMA，又稱雙抗體夾心法

從加樣測定順序上看，有三種方法：固相抗體先與未知抗原結(jié)合，再與標(biāo)記抗體結(jié)合（正向兩步法）。然后去除游離的標(biāo)記抗體，測固相抗體一抗原一標(biāo)記抗體復(fù)合物的放射性計數(shù)；未知抗原先與標(biāo)記抗體結(jié)合，再與同相抗體結(jié)合（反向兩步法）。然后去除游離的標(biāo)記抗體，測固相抗體一抗原一標(biāo)記抗體復(fù)合物的放射性計數(shù)；未知抗原與固相抗體和標(biāo)記抗體同時反應(yīng)（一步法，又稱同時加樣法）。然后去除游離的標(biāo)記抗體，測固相抗體一抗原一標(biāo)記抗體復(fù)合物的放射性計數(shù)。
這三種方法都生成夾心狀的抗體一抗原一抗體復(fù)合物，故又稱雙抗體夾心法。

糖類抗原CA50，CA125就用的是其中的第三種方法（一步法），血清中的未知抗原與固相抗體和標(biāo)記抗體同時反應(yīng)，生成夾心狀的抗體一抗原一抗體復(fù)合物，然后去除游離的標(biāo)記抗體，測固相抗體一抗原一標(biāo)記抗體復(fù)合物的放射性計數(shù)。

三、RIA法的影響因素

pH和離子強度；反應(yīng)溫度，溫度一般為37℃，也有45℃，室溫，4℃ 冰箱；反應(yīng)時間，操作中的注意事項：戴手套、防護鏡等，將試劑盒從冰箱中取出，室溫下放置30 min方可使用。

（1）編號：*排是標(biāo)準(zhǔn)管：根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品濃度由低到高A，B，C，D，E，F(xiàn)，G……；第二排是被測樣品1，2，3，4，5，6，……。

（2）加樣要準(zhǔn)確，移液器的使用（兩個檔位，一檔吸人，二檔排出）吸頭（一個標(biāo)本一個吸頭，避免互相污染）。加試劑：先看瓶簽，再搖勻，zui后吸人。（標(biāo)記物一般為紅色，一抗為蘭色）。

（3）溫育時間要保證：按說明書中所要求的時間溫育，可以延長，不能縮短。

（4）分離劑加入：混勻靜置時間，可以延長，不能縮短。保證抗原抗體復(fù)合物與第二抗體的充分結(jié)合。

（5）溫度：注意觀察水浴箱的水溫，誤差不能太大，為±1℃ ，室溫21℃左右。

（6）離心時間：也應(yīng)按說明書中所要求來操作，轉(zhuǎn)速一般為3 500r/min。往離心機里放反應(yīng)管時，盡量讓它直立（因為傾斜可能會使液體流出）。吸上清液時，沉淀物在試管底部，真空泵的吸頭頭部不能直接插人到試管底部*（會吸走沉淀物，而我們的目的是分離保留沉淀物），應(yīng)該使吸頭貼著試管管壁往下放，并且試管要稍微傾斜，但要在即將插到沉淀物邊緣時停止，快速上升取出。少留一點點上清液也可。主要是保證沉淀物完整。

（7）進人免疫計數(shù)器測量時，注意觀察做出的曲線好壞：是不是需要修改，剔除壞點。

（8）報結(jié)果：碰到異常結(jié)果，要再次看一看沉淀物是否都在，患者情況如何，結(jié)果是否與患者情況相符，方可報出。非競爭性RIA法中，清洗固相包被珠時，清洗次數(shù)要嚴(yán)格按說明書中所要求來操作，不得減少。雖然RIA法的影響因素很多，但操作中只要注意上述事項，RIA法的穩(wěn)定性還是相當(dāng)不錯的。主要是它存在放射污染，這個問題不易解決，影響了它以后的發(fā)展，如今電化學(xué)發(fā)光免疫分析，化學(xué)發(fā)光免疫分析，酶聯(lián)免疫分析，磁酶免疫分析等相繼推出，發(fā)展很快。RIA法將被淘汰。