ELISA酶聯(lián)免疫法檢測ABA含量

ELISA檢測法因其快捷的實(shí)驗(yàn)原理被廣泛使用，但是在實(shí)驗(yàn)過程中操作難免有點(diǎn)繁瑣。下面就讓上海勁馬來為您講解用ELISA酶聯(lián)免疫法檢測ABA含量。
實(shí)驗(yàn)原理 
本方法是一種固相抗原型酶聯(lián)免疫法(enzyme Linked Immuno Sorbent Assay ELISA),先將ABA蛋白質(zhì)復(fù)合物與固相載體(聚苯乙烯微量滴定板)結(jié)合,然后將待測的ABA(樣品或標(biāo)準(zhǔn)品)和兔抗ABA抗體加入微量滴定板的孔中,進(jìn)行競爭反應(yīng),接著棄去上清液,洗滌固相表面,加入酶標(biāo)二抗使其與結(jié)合在固相ABA上的抗體反應(yīng),zui后去除多余的未反應(yīng)的酶標(biāo)二抗,測定與固相結(jié)合的酶活性,酶活性和待測ABA含量呈負(fù)函數(shù)關(guān)系,即固相ABA結(jié)合的抗體與酶標(biāo)二抗量(OD或B%)隨待測ABA含量增加而減少,以一系列已知濃度的ABA的OD值制圖而獲得標(biāo)準(zhǔn)競爭性抑制曲線,對于未知樣品B,只要在同樣條件下測定反應(yīng)后的OD值,就可以從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查到ABA的量。
測定方法 
1.包被：在微量滴定板內(nèi)準(zhǔn)確加入100μLABA包被液，37℃濕盒過夜。 
2.標(biāo)樣稀釋：取8支試管每管加150μLDB，*管中加入50μL（2000ng/50μL）標(biāo)準(zhǔn)液，充分渦旋后，取50μL至第二號管中，同樣渦旋后，取50μL到第三管；依次稀釋到第六管，稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)ABA依次為1000ng、500ng、250ng、125ng、62.5ng、31.25ng、15.625ng、7.8125ng/50μL。 
3. 洗板：從37℃濕盒中取出滴定板，恢復(fù)到室溫后，棄去包被液，用WB（洗滌緩沖液）洗滌三次，甩干（吸水紙）。 
4.加樣：1～8孔對應(yīng)加入ABA標(biāo)樣50μL，10號孔相應(yīng)加入zui濃ABA標(biāo)樣，9號孔加50μLDB，三排重復(fù)；然后每孔加50μL抗體，37℃ 45分鐘。 
5.洗板： 
6.加酶標(biāo)二抗：每孔加100μL，37℃反應(yīng)1小時(shí)。 
7.洗板： 
8.顯色：各孔加10μLOPD顯色液，37℃ 20分鐘。 
9.終止反應(yīng)：各孔加50μL 6NH2SO4。 
10.讀數(shù)：490nm讀取OD值。其中10號孔調(diào)零,而9號孔為zui大值(B0),1~8號孔的OD值為B。 
11.結(jié)果計(jì)算：以In（B/B0）∕（1－B/B0）為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)ABA濃度的常用對數(shù)（lg［ABA］）為橫坐標(biāo),繪制曲線。
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