百蕊生物：AMP含量試劑盒現貨供應

AMP含量試劑盒說明書
測定意義：
AMP廣泛存在于動物、植物、微生物和培養細胞中，是描述細胞能量代謝狀態的主要參數。測定AMP含量并且計算能荷，能夠反映能量代謝狀態。
測定原理：
AMP在254 nm下有吸收峰，可以利用液相色譜法測定其含量。
需自備的實驗用品：
液相色譜儀、低速離心機、溶劑抽濾裝置、針頭式過濾器（水系，50個，0.22μm）、濾膜（水系和有機系各1個，0.45μm）、C18柱（4.6 ×150 mm）、可調式移液器、樣品瓶（50個，2mL）、甲醇（色譜級，300 mL）和蒸餾水。
試劑的組成和配制：
試劑一：液體60mL×1瓶，4℃保存；
試劑二：液體60mL×1瓶，4℃保存；
試劑三：粉劑1×1瓶，粉劑2×1瓶，4℃保存；臨用前用少量蒸餾水將粉劑1和粉劑2溶解后倒入1000mL容量瓶中，用蒸餾水定容至1000mL，形成流動相緩沖液基質（注：試劑瓶中的粉劑要沖洗干凈）, 4℃可保存1周；
試劑四：AMP標準品5mg×1支，-20℃保存。臨用前加入1mL雙蒸水，配成5mg/mL 溶液，配好后-20℃可保存1周；
實驗前的準備工作：
1、將雙蒸水1000 mL、流動相緩沖液基質1000 mL和甲醇300 mL用0.45 μm的濾膜抽濾，以除去溶劑中的雜質，防止堵塞色譜柱。（注：雙蒸水和緩沖液基質用水系濾膜抽濾，甲醇用有機系濾膜抽濾）。
2、流動相的配制：將抽濾完畢的流動相緩沖液基質1000 mL與甲醇配比為99.9：0.1（v/v），即取999mL緩沖液基質與1mL甲醇混合。
3、將抽濾完畢的甲醇和雙蒸水配比成的甲醇， 10%的甲醇，雙蒸水各250 mL。
將2和3中的溶劑超聲30分鐘，以脫去溶劑中的氣泡，防止堵塞色譜柱。
AMP的提取：
1、組織的處理：準確稱取組織重量0.1g，加入1mL試劑一，提取AMP， 4000 g常溫離心15 min，取上清液，加入等體積的試劑二，混勻，4000 g，常溫離心15 min，取上清，0.22μm水系微孔濾膜過濾后冰上放置，待測。
2、細胞處理：收集約30 mL細胞，離心菌體經干燥后，加入1 mL 試劑一，超聲破壁細胞(950 W，30%，15 min，工作1 s間隔2 s)，4000 g，常溫離心15 min，取上清液，加入等體積的試劑二，混勻，4000 g，常溫離心15 min，取上清，0.22μm水系微孔濾膜過濾后冰上放置，待測。
AMP含量測定操作步驟：
1. 開啟電腦、檢測器和泵，安裝上色譜柱，打開empower軟件，在方法組中設置進樣量20 μL，流速1 mL/min，保留時間10min，檢測波長254nm,設置完畢保存方法組。
2. 用的甲醇、10%的甲醇、雙蒸水按甲醇濃度從大到小的順序洗色譜柱30min。
3. 用流動相洗柱子，待基線穩定后開始加樣。
4. 加入標準品20 μL，在10min內可分離AMP， AMP的保留時間在7min左右（柱子不同，保留時間有差異），計算不同濃度的AMP標準品的峰面積。
5. 加入樣品20 μL，在相應保留時間處檢測AMP的峰面積。
AMP含量的計算：
將5mg/ml的AMP標準品用雙蒸水分別稀釋成100 μg/ml、80 μg/ml、60 μg /ml、40 μg /ml和20 μg /ml的AMP標準品溶液，以標準品濃度（μg/ml）為橫坐標，峰面積為縱坐標分別計算AMP標準曲線。
注：標準品的稀釋倍數要根據樣品中AMP濃度確定，樣品中AMP的峰面積必須落在不同濃度的AMP標準品的峰面積之內，該標準品稀釋倍數只是一個參考。