梯度PCR實(shí)際操作中出現(xiàn)的問題解析

梯度PCR是針對每臺PCR儀如何設(shè)置合適的退火溫度進(jìn)行摸索。它是以合成引物的退火溫度為參考值，在進(jìn)行同一個(gè)PCR反應(yīng)時(shí)，同時(shí)設(shè)置多個(gè)退火溫度進(jìn)行PCR實(shí)驗(yàn)。這些退火溫度呈現(xiàn)梯度遞增或遞減，通過梯度PCRzui終確定適合儀器的退火溫度。

但我們在實(shí)際應(yīng)用梯度PCR中仍然會遇到諸多困難。例如我們在一臺PCR儀上摸索出合適的退火溫度，當(dāng)換到另一臺儀器（同一型號）上進(jìn)行相同PCR實(shí)驗(yàn)時(shí)，有時(shí)獲得的結(jié)果會不理想；在一臺PCR儀摸索出的退火溫度，換到其它品牌或型號的PCR儀上時(shí)，獲得的結(jié)果也是不理想；使用一種耗材獲得好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，當(dāng)更換其它耗材時(shí)，同樣獲得不理想的結(jié)果等。

這主要是由于進(jìn)行不同的PCR實(shí)驗(yàn)和使用不同儀器和/或耗材進(jìn)行PCR實(shí)驗(yàn)時(shí)，模塊溫度與樣品溫度差異的不確定性所造成的。這樣我們就能夠了解進(jìn)行梯度PCR的原因：不是由于獲得退火溫度理論值不準(zhǔn)確，而是由于模塊溫度與樣品溫度的不一致性所造成。梯度PCR摸索出的條件只有在PCR實(shí)驗(yàn)、儀器、試劑和耗材等一致時(shí)才是有效的，否則任何一個(gè)組成要素的改變又會帶來新的不確定性。

我們知道在PCR儀上設(shè)置的溫度是模塊溫度，但由于受到模塊的材質(zhì)及熱傳導(dǎo)效率、PCR反應(yīng)管的厚度及與模塊貼合的緊密性等因素的影響，模塊的熱能不能傳遞到反應(yīng)管中，這就導(dǎo)致了模塊溫度與反應(yīng)管中的溫度的不一致性。

變性溫度（95℃）下降到退火溫度這個(gè)過程時(shí)，模塊溫度與樣品溫度逐漸出現(xiàn)差異。當(dāng)三種模塊（Block55/53/57）分別下降到退火溫度時(shí)，模塊溫度會進(jìn)入平臺期，此時(shí)樣品溫度與模塊溫度出現(xiàn)如下的差異：當(dāng)模塊溫度進(jìn)入平臺期5秒鐘時(shí)，樣品與模塊溫度相差6.2℃；10秒鐘時(shí)相差3.0℃；15秒時(shí)相差1.5℃。由于樣品溫度要達(dá)到模塊溫度會出現(xiàn)一定的延遲，所以為解決這種延遲我們往往需要進(jìn)行梯度PCR實(shí)驗(yàn)，摸索出適合儀器的退火溫度。

顯然要*解決以上問題，研究人員需要一款能夠?qū)崿F(xiàn)率的熱能傳導(dǎo)，并保持模塊溫度與樣品溫度高度一致的PCR儀來進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。這時(shí)我們無需梯度PCR就可以解決模塊和樣品之間存在的溫度差異及差異的不確定性等諸多問題，同時(shí)這也大大簡化了PCR程序，更加省時(shí)、省試劑。