甲醛洋菜膠體電泳

甲醛洋菜膠體電泳 （formaldehyde-agarose gel electrophoresis）甲醛是一種常用的RNA 變性劑。在進(jìn)?分析時，必須先配制含有甲醛的洋菜膠體，RNA 也必須先以甲醛及formamide 進(jìn)?變性處?，以確保其二?結(jié)構(gòu)充分被打開。由于甲醛可能是一種致癌物質(zhì)，配制膠體及進(jìn)?電泳分析時?應(yīng)在抽氣櫥里小心操作；進(jìn)?電泳時所使用的緩沖液為MOPS （3-[N-morpholino] propanesulfonic acid）。此外，含有甲醛的洋菜膠體比較??，容?破?，在移動膠體時應(yīng)特別??。由于rRNA 占細(xì)胞RNA總?的80~85%，以ethidium bromide 染色后，呈現(xiàn)于膠體上的兩個主要RNA色帶應(yīng)該分別是large 與small rRNAs （真核生物為28S 與18S，原核生物為23S 與16S）；散布于small rRNA 附近，呈淡淡smear 的就是mRNAs，這是因?yàn)閙RNAs 存在??多，而且長??一的緣故。長?較短的5S rRNA 及tRNA 等則在膠體下方也以特定色帶呈現(xiàn)。

 
    儀器用具：65℃恒溫水槽；微?離心機(jī)；Mupid II 迷你電泳槽及鑄膠器；UV transilluminator；防護(hù)面罩；拍?得相機(jī)；抽氣櫥
 
 
    藥品試劑：
    自菌體抽取的RNA （I-1, I-2, U-1, and U-2） 與胞外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)所制備的正意股及反意股RNA （#1, #2, #3, and #4）。
    5×formaldehyde gel running buffer （0.1 M MOPS, pH 7.0; 40 mM sodium acetate; 5 mM EDTA）
    Formaldehyde gel loading buffer （0.25% bromophenol blue; 0.25% xylene cyanol;50% glycerol; 1 mM EDTA）
    Ethidium bromide （1 μg/μL in dH2O/DEPC）
    dH2O/DEPC
 
    方法步驟：
    ◆ 注意：
    a. 下?實(shí)驗(yàn)主要參照Sambrook and Russell （2001） 的方法。
    b. 進(jìn)?下?實(shí)驗(yàn)時請務(wù)必戴手套。
    c. 甲醛與formamide ?放在抽氣櫥內(nèi)。
    準(zhǔn)備一片1.2%甲醛洋菜膠體：
    1） 秤取0.48 g agarose置100 mL血清瓶，加入25 mL dH2O/DEPC。
    2） 以微波?加熱溶解的后，微微晃動血清瓶使混合均勻，再移至60℃恒溫水槽靜置5 min。
    3） 將裝著agarose 溶液的血清瓶移至抽氣櫥，加入8 mL 的5× formaldehyde gel running buffer 及7.2 mL 的甲醛，輕輕搖晃血清瓶以?混合均勻。
??  膠體總體積為40 mL，為?避免agarose 溶液因溫?快速下?，很快?凝固，應(yīng)?求動作迅速，但應(yīng)避免劇?搖晃，以免?出一大堆氣泡，影響膠體凝結(jié)。
    4） 盡速于抽氣櫥內(nèi)把混合液倒入膠體鑄模，并插入樣本梳 （teeth comb）。膠體凝固至少需時30 min。
    電泳：
    1） 要進(jìn)?電泳時，把已凝固的洋菜膠體放進(jìn)電泳槽，并加入適?1×formadehyde gel running buffer。
    2） 以50 V 定電壓預(yù)跑5 min。
    3） 依序注入上?8 個RNA 樣本，以50 V 定電壓進(jìn)?電泳，待追蹤染劑移動至膠體三分的二處時，關(guān)閉電源，將膠體移至UV transilluminator box，觀察RNA 色帶的存在情形，并拍照存證。
??  注意：這一片膠體往下將用?進(jìn)??方轉(zhuǎn)印實(shí)驗(yàn)，請小心處置！