上海百蕊報(bào)道：DNA測(cè)序技術(shù)

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DNA測(cè)序技術(shù)，又叫基因測(cè)序技術(shù)。

人類基因組這部由A、T、G、C四個(gè)字母組成的卷帙浩繁的生命天書(shū)如同一座寶庫(kù)，保藏著幾千年來(lái)人們迫切想知道的秘密，DNA測(cè)序技術(shù)就好似“芝麻開(kāi)門(mén)"這樣的咒語(yǔ)，是我們打開(kāi)寶庫(kù)的金鑰匙世界上*個(gè)測(cè)定DNA序列的方法是由英國(guó)生化學(xué)家弗雷德里克·桑格爾發(fā)明的。自此DNA測(cè)序的速度就一直呈加速態(tài)勢(shì)。2001年人類基因組草圖耗資4.37億美元，耗時(shí)13年。到了2007年，*個(gè)完整人類基因組序列圖譜的誕生只花費(fèi)了150萬(wàn)美元，3個(gè)月就搞定。2009年1月2日，美國(guó)加州太平洋生物科學(xué)公司的科學(xué)家喬納斯·考爾拉赫、斯蒂芬·特納及其研究小組在《科學(xué)》雜志上發(fā)表論文稱，他們將納米技術(shù)與芯片技術(shù)相結(jié)合，發(fā)明了一種新型測(cè)序方法，速度是現(xiàn)有技術(shù)的3萬(wàn)倍。

DNA sequencing technology

Sanger 法測(cè)序的原理就是利用一種DNA聚合酶來(lái)延伸結(jié)合在待定序列模板上的引物。直到摻入一種鏈終止核苷酸為止。每一次序列測(cè)定由一套四個(gè)單獨(dú)的反應(yīng)構(gòu)成，每個(gè)反應(yīng)含有所有四種脫氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入*的一種不同的雙脫氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基團(tuán)，使延長(zhǎng)的寡聚核苷酸選擇性地在G、A、T或C處終止。終止點(diǎn)由反應(yīng)中相應(yīng)的雙脫氧而定。每一種dNTPs和ddNTPs的相對(duì)濃度可以調(diào)整，使反應(yīng)得到一組長(zhǎng)幾百至幾千堿基的鏈終止產(chǎn)物。它們具有共同的起始點(diǎn)，但終止在不同的的核苷酸上，可通過(guò)高分辨率變性凝膠電泳分離大小不同的片段，凝膠處理后可用X- 光膠片放射自顯影或非同位素標(biāo)記進(jìn)行檢測(cè)。

非同位素銀染測(cè)序系統(tǒng)操作技術(shù)

Promega公司的SILVER SEQUENCETM DNA測(cè)序系統(tǒng)是一種無(wú)放射性的序列分析系統(tǒng)，它通過(guò)靈敏的銀染方法檢測(cè)凝膠中的條帶。銀染提供了一種對(duì)于放射性或熒光法來(lái)說(shuō)更加快速，廉價(jià)的替代方法。測(cè)序結(jié)果可以在同一天內(nèi)得到；電泳完成后經(jīng)90分鐘就可讀序，這是常規(guī)的放射性測(cè)序法做不到的。 此外, SILVER SEQUENCETM系統(tǒng)用未修飾的5'OH寡聚核苷酸作為引物，減少了特殊修飾寡聚核苷酸的花費(fèi)。該系統(tǒng)不需要放射性方法中對(duì)同位素的謹(jǐn)慎操作，也不需要熒光法或化學(xué)發(fā)光技術(shù)的昂貴試劑。另外，也不需要象大多數(shù)熒光法那樣用儀器來(lái)檢測(cè)序列條帶。

DNA測(cè)序策略

Taq DNA聚合酶在95℃時(shí)*的熱穩(wěn)定性。本系統(tǒng)利用的測(cè)序級(jí)Taq DNA聚合酶是一種Taq DNA聚合酶的修飾產(chǎn)品，對(duì)于雙鏈DNA模板有非常好的效果，具有高度的準(zhǔn)確性，能產(chǎn)生均一的條帶，且背景低。

SILVER SEQUENCETM系統(tǒng)包含被修飾的核苷酸混合物，如7-去氮dGTP(7-deaza dGTP，或dITP)替代dGTP可清除由GC豐富區(qū)域所引起的條帶壓縮現(xiàn)象。

退火溫度是熱循環(huán)測(cè)序中zui重要的因素。高退火溫度可減少模板二級(jí)結(jié)構(gòu)。提高引物結(jié)合模板配對(duì)的嚴(yán)謹(jǐn)性。鏈重退火和模板二級(jí)結(jié)構(gòu)則限制了小片斷PCR產(chǎn)物(<500bp)得到清楚的序列數(shù)據(jù)的能力。引物延伸起始于每個(gè)循環(huán)的退火階段。在較低溫度時(shí)，聚合酶可能會(huì)遇到堅(jiān)固的二級(jí)結(jié)構(gòu)區(qū)域，它可導(dǎo)致聚合酶解離。則在四個(gè)電泳道中均有同一相對(duì)位置的條帶。因?yàn)檫@些原因，應(yīng)該使用盡可能高的退火溫度。對(duì)于有牢固二級(jí)結(jié)構(gòu)的模板建議使用95℃變性、70℃退火/延伸的循環(huán)模式。一般來(lái)說(shuō)，較長(zhǎng)的引物及GC含量高的引物能得到較強(qiáng)的信號(hào)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，>24mer的GC含量約為50%的引物可得到*結(jié)果。

由于本系統(tǒng)采用熱循環(huán)裝置, 與常規(guī)的測(cè)序方法相比具有如下幾點(diǎn)好處：(1).本方法線性擴(kuò)增模板DNA產(chǎn)生足夠的產(chǎn)物使銀染技術(shù)能夠檢測(cè)序列條帶，測(cè)序反應(yīng)需要0.03-- 2pmol模板DNA, 隨模板種類而定。(2). 在每一個(gè)變性循環(huán)中的高溫可以取代對(duì)雙鏈DNA(dsDNA)模板的堿變性及乙醇沉淀過(guò)程，變性循環(huán)也有助于消除由于線性dsDNA模板(如PCR反應(yīng)產(chǎn)物)快速重退火所引起的問(wèn)題。(3). 高溫聚合酶反應(yīng)減弱了DNA模板的二級(jí)結(jié)構(gòu)，允許聚合酶穿過(guò)高度二級(jí)結(jié)構(gòu)化的區(qū)域。

2材料

待測(cè)已提純的DNA，可為單鏈，也可為雙鏈。

科學(xué)家在一個(gè)蝕刻有納米結(jié)構(gòu)的微陣列芯片上放置了數(shù)以千計(jì)的波導(dǎo)管。這是一種微型、中空的金屬管，直徑大約20納米，體積大約是1毫微微微升，一個(gè)DNA分子外加一個(gè)DNA多聚酶分子便可將管內(nèi)空間占滿。這樣一來(lái)，僅在一塊小小的芯片上，就能同時(shí)進(jìn)行數(shù)千個(gè)測(cè)序反應(yīng)。尤其可貴的是，在這種微型波導(dǎo)管中進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)時(shí)，干擾會(huì)顯著減少，也就是說(shuō)可以大幅提高度。

目前的產(chǎn)品中，每個(gè)芯片上的波導(dǎo)管大約有3000個(gè)，太平洋生物科學(xué)公司打算2010年推出這一級(jí)別的產(chǎn)品。據(jù)公司創(chuàng)始人特納預(yù)計(jì)，到2013年，將實(shí)現(xiàn)每張芯片放置一百萬(wàn)個(gè)波導(dǎo)管，屆時(shí)將能在半小時(shí)內(nèi)測(cè)完人類基因組全序列，度達(dá)到99.999%，花費(fèi)低于1000美元。

盡管美國(guó)得克薩斯州貝勒醫(yī)學(xué)院的邁克爾·梅茲克博士表示特納的展望過(guò)于樂(lè)觀，但這樣驚人的速度讓我們仿佛看到了計(jì)算機(jī)CPU曾經(jīng)的前進(jìn)步伐——集成電路上容納的晶體管數(shù)目，每18個(gè)月就會(huì)增加一倍，性能也將提升一倍。有人評(píng)論道，DNA測(cè)序技術(shù)將跟隨計(jì)算機(jī)技術(shù)和通訊技術(shù)成為第三個(gè)“摩爾定律化"的學(xué)科產(chǎn)業(yè)。

3設(shè)備

DNA測(cè)序儀，性能特點(diǎn)，自動(dòng)化程度高，提供連續(xù)、無(wú)需監(jiān)控的操作，自動(dòng)灌膠、上樣、電泳分離、檢測(cè)及數(shù)據(jù)分析，可連續(xù)運(yùn)行24小時(shí)無(wú)需人工干預(yù)。樣品分析量大，一束毛細(xì)管可同時(shí)對(duì)16個(gè)樣品進(jìn)行全自動(dòng)分析，一天可完成數(shù)百個(gè)樣品的測(cè)序或片段分析工作。*的熒光檢測(cè)系統(tǒng)，采用光柵分光，CCD攝像機(jī)成像技術(shù)，實(shí)現(xiàn)多色熒光同時(shí)檢測(cè)，與傳統(tǒng)的濾鏡及光電倍增管的檢測(cè)方式相比，光柵及CCD的優(yōu)勢(shì)在于更新熒光化學(xué)時(shí)無(wú)需更換任何硬件設(shè)備。從激光光源發(fā)出的光線被光學(xué)元件分成兩股，16根毛細(xì)管被一束激光同時(shí)從兩面照射，有效提高熒光檢測(cè)靈敏度和均一性。DNA測(cè)序儀在2011年前多由美國(guó)生產(chǎn)。

2011年4月18日，由中科院北京基因組研究所與中科院半導(dǎo)體研究所承擔(dān)的“模塊化DNA分析系統(tǒng)"項(xiàng)目通過(guò)評(píng)審驗(yàn)收。這標(biāo)志著我國(guó)在第二代DNA測(cè)序儀研發(fā)方面，形成了具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的高通量DNA測(cè)序技術(shù)及其系統(tǒng)樣機(jī)。日前，驗(yàn)收組對(duì)該項(xiàng)目進(jìn)行了測(cè)試和驗(yàn)收考核。驗(yàn)收組認(rèn)為，此項(xiàng)目完成了儀器研制項(xiàng)目實(shí)施方案所要求的各項(xiàng)技術(shù)指標(biāo)，有效測(cè)序片段數(shù)量、平均讀長(zhǎng)和有效序列數(shù)據(jù)總產(chǎn)量等關(guān)鍵技術(shù)性能指標(biāo)遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于立項(xiàng)指標(biāo)，該成果實(shí)現(xiàn)了與主流設(shè)備性能相當(dāng)?shù)膰?guó)產(chǎn)化DNA測(cè)序能力，在基因組學(xué)、生物信息學(xué)，乃至生命科學(xué)諸多方向的基礎(chǔ)研究和應(yīng)用研究方面具有重要實(shí)用價(jià)值。項(xiàng)目負(fù)責(zé)人、中科院北京基因組所副所長(zhǎng)于軍表示，計(jì)劃下一步將繼續(xù)開(kāi)發(fā)適應(yīng)于我國(guó)科研需求的下一代測(cè)序儀、配套試劑、芯片和測(cè)序分析軟件等，使這一設(shè)備全面實(shí)現(xiàn)系統(tǒng)功能。

高壓電泳儀，測(cè)序用電泳槽，制膠設(shè)備，PCR儀。

4試劑

（1）SILVER SEQUENCETM DNA測(cè)序試劑盒。

（2）丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺儲(chǔ)備液（38%丙烯酰胺 W/V，2%甲叉雙丙烯酰胺 W/V)：95g丙烯酰胺，5g甲叉雙丙烯酰胺溶于140ml 雙蒸水中，定容至250ml，0.45mm過(guò)濾器過(guò)濾后，貯于棕色瓶中，置于4℃冰箱可保存2周。

DNA測(cè)序技術(shù)

（3）10%過(guò)硫酸銨，0.5g過(guò)硫酸銨溶于4ml水中，定容至5ml，應(yīng)新配新用。

（4）10×TBE緩沖液（1 mol/L Tris, 0.83mol/L 硼酸，10mmol/L EDTA)： 121.1g Tris，51.35g硼酸，3.72g Na2 EDTA ·2H2O，溶于雙蒸水中定容至1升，置于4℃下可貯存2周，其pH約為8.3。

（5）TBE電極緩沖液：10×TBE 緩沖液稀釋至1×TBE備用。

（6）TEMED

（7）固定/停止溶液：10%冰醋酸（V/V）配制2升備用。

（8）染色溶液：*2克，甲醛3ml，溶于2升超純水中備用。

（9）顯影溶液：60克碳酸鈉（Na2CO3)溶于2升超純水中，使用前加3ml 37% 甲醛和 40ml*溶液（10mg/ml)。

（10）95%乙醇。

（11）0.5%冰乙酸。

（12）Sigmacote (Sigma CAT. #SL-2)。

5操作

成功地使用銀染測(cè)序系統(tǒng)需要對(duì)提供的操作方法進(jìn)行仔細(xì)考慮。銀染不如放射性檢測(cè)法靈敏，而需要更多的模板量，此外，也不可能通過(guò)延長(zhǎng)X-光膠片曝光時(shí)間的方法增加信號(hào)強(qiáng)度。因此，請(qǐng)使用*的DNA模板量, 每次均使用所提供的對(duì)照檢查系統(tǒng)的可靠性，并且注意如下幾點(diǎn)：

（1） DNA的濃度和純度必須經(jīng)過(guò)瓊脂糖凝膠電泳或熒光法測(cè)定, 樣品應(yīng)與已知量DNA一起電泳。

（2） 分光光度法對(duì)于很多DNA提取物包括質(zhì)粒小量制備來(lái)說(shuō)，并不能給出一個(gè)可信的DNA濃度估計(jì)，混雜的染色體DNA、蛋白、RNA、有機(jī)物及無(wú)機(jī)化合物均可能有260 nm光吸收。因此，分光光度法常常錯(cuò)誤地高估DNA濃度。

DNA測(cè)序儀

（3） DNA制備過(guò)程中用核糖核酸酶處理所產(chǎn)生核糖核苷酸，雖然它們?cè)陔娪竞驞NA樣品的前面，并不能觀察到，但它們?nèi)詴?huì)有260nm光吸收。

測(cè)序反應(yīng)

1. 對(duì)于每組測(cè)序反應(yīng)，標(biāo)記四個(gè)0.5ml eppendorf管(G、A、T、C)。每管加入2ml適當(dāng)?shù)膁/ddNTP混合物(d/ddNTP Mix)。各加入1滴(約20ml)礦物油，蓋上蓋子保存于冰上或4℃?zhèn)溆谩?/p>

2. 對(duì)于每組四個(gè)測(cè)序反應(yīng),在一個(gè)eppendorf管中混合以下試劑：

（1） 樣品反應(yīng)：

質(zhì)粒模板DNA 2.1pmol

5×測(cè)序緩沖液 5ml

引物 4.5pmol

無(wú)菌ddH2O 至終體積16ml

（2）對(duì)照反應(yīng)

pGEM-3Zf(+)對(duì)照DNA(4mg)　 4.0ml

5×測(cè)序緩沖液 5ml

pUC/M13正向引物(4.5pmol) 3.6ml

無(wú)菌ddH2 O 至終體積 16 ml

3. 在引物/模板混合物(以上第2步)中加入1.0ml測(cè)序級(jí)Taq DNA聚合酶(5u/ml)。用吸液器吸動(dòng)幾次混勻。

4. 從第3步的酶/引物/模板混合物中吸取4ml加入每一個(gè)d/ddNTP混合物的管內(nèi)。

5. 在微量離心機(jī)中離心一下，使所有的溶液位于eppendorf管底部。

6. 把反應(yīng)管放入預(yù)熱至95℃的熱循環(huán)儀，以[注意]中循環(huán)模式為基準(zhǔn)，開(kāi)始循環(huán)程序。對(duì)于每個(gè)引物/模板組合都必須選擇*退火溫度。下列程序一般能讀出從引物開(kāi)始350堿基的長(zhǎng)度。

7. 熱循環(huán)程序完成后，在每個(gè)小管內(nèi)加入3μl DNA測(cè)序終止溶液，在微量離心機(jī)中略一旋轉(zhuǎn)，終止反應(yīng)。

[注意] 1、測(cè)序所用模板DNA的量一般按下面要求加入：

模板種類/長(zhǎng)度 模板量

200bp (PCR產(chǎn)物) 16ng(120fmol)

3000-5000bp（超螺旋質(zhì)粒DNA) 4mg (2pmol)

48000bp(λ,粘粒DNA) 1mg(31fmol)

由于超螺旋質(zhì)粒產(chǎn)生的信號(hào)比松弛的線性雙鏈DNA弱，因此使用超螺旋質(zhì)粒作為模板時(shí)其用量要比其它模板大一些。

2、計(jì)算與4.5pmol相當(dāng)?shù)囊锛{克數(shù)可用以下一般公式：

4.5pmol=1.5ng×n,其中n為引物堿基數(shù)

計(jì)算與1pmol相當(dāng)?shù)囊镂⒖藬?shù)可用以下一般公式：

dsDNA:1pmol=(6.6×10-4 mg)×n,其中n為模板堿基對(duì)數(shù)

ssDNA:1pmol=(3.3×10-4 mg)×n,其中n為模板堿基數(shù)

3、為阻止Taq DNA聚合酶延伸非特異性退火引物， 熱循環(huán)儀必須預(yù)熱至95℃。溫度變換應(yīng)越快越好。下面的循環(huán)時(shí)間不包括變溫時(shí)間。如果你無(wú)法確定使用何種模式，建議從模式1開(kāi)始。

模式1：適用于引物<24堿基或GC含量<50%

95℃ 2分鐘。然后： 95℃ 30秒(變性), 42℃ 30秒(退火), 70℃ 1分鐘(延伸)。

模式2:適用于≥24堿基或略短的GC含量≥50%的引物。

95℃ 2分鐘, 然后: 95℃ 30秒(變性), 70℃ 30秒(退火/延伸)。 4. 在加入終止溶液之后樣品可在4℃保存過(guò)夜。

測(cè)序凝膠板的制備

玻璃板的處理

銀染測(cè)序的玻璃板一定要非常清潔，一般先用溫水和去污劑洗滌，再用去離子水沖洗玻璃板，除去殘留的去污劑，zui后用乙醇清洗玻璃板。玻璃板上的去污劑微膜可能導(dǎo)致凝膠染色時(shí)背景偏高(棕色)。短玻璃板經(jīng)粘合溶液處理可將凝膠化學(xué)交聯(lián)于玻璃板上。這一步對(duì)于在銀染操作過(guò)程中防止凝膠撕裂至關(guān)重要。

短玻璃板的處理

A. 在1ml 95%乙醇, 0.5%冰乙酸中加入5ml粘合硅烷(Bind Silane), 配成新鮮的粘合溶液。

B. 用經(jīng)浸透新配的粘合溶液浸透的吸水棉紙擦拭仔細(xì)清洗過(guò)并已經(jīng)自然干燥的玻璃板, 整個(gè)板面都必須擦拭。

C. 4-5分鐘后, 用95%乙醇單向擦玻璃板, 然后略用力沿垂直方向擦拭。重復(fù)三次這一清洗過(guò)程, 每次均須換用干凈的紙, 除去多余的粘合溶液。

[注意] 1. 在95%乙醇單向擦玻璃板時(shí)過(guò)度用力會(huì)帶走過(guò)多的粘合硅烷, 使凝膠不能很好地粘附。

2. 準(zhǔn)備長(zhǎng)玻璃板之前要更換手套，防止粘染粘合硅烷。

3、防止粘合溶液沾染在長(zhǎng)玻璃板上是很重要的, 否則將導(dǎo)致凝膠撕裂。

長(zhǎng)玻璃板的處理

A. 用浸透Sigmacote溶液的棉紙擦拭清洗過(guò)的長(zhǎng)玻璃板。

B. 5-10分鐘后用吸水棉紙擦拭玻璃板以除去多余的Sigmacote溶液。

[注意] 1. 用過(guò)的凝膠可在水中浸泡后用剃須刀片或塑料刮去。玻璃板須用去污劑*清洗。或者凝膠用10% NaOH浸泡后除去。為防止交叉污染, 用于清洗短玻璃板的工具必須與清洗長(zhǎng)玻璃板的工具分開(kāi), 如果出現(xiàn)交叉污染, 以后制備的凝膠可能撕裂或變得松弛。

凝膠的制備

（1）玻璃板經(jīng)粘合硅膠和Sigmacote處理后，即可固定玻璃板。該方法是用0.2mm或0.4mm厚的邊條置于玻璃板左右兩側(cè)，將另一塊玻璃板壓于其上。在長(zhǎng)玻璃板的一側(cè)插入鯊魚(yú)齒梳平的一面邊緣，用夾子固定住。

（2）根據(jù)所需要的凝膠濃度，按下表制備測(cè)序凝膠，一般6%-8%的膠濃度可獲得較好的結(jié)果。配制過(guò)程中，先用適量雙蒸水溶解尿素，再加入 Acr&Bis和10×TBE緩沖液，再用雙蒸水調(diào)終體積至99.2ml，并用0.45mm的濾膜過(guò)濾，然后加過(guò)硫酸銨和TEMED。溶解尿素時(shí)不必加熱。如果確需加熱則應(yīng)等溶液*冷卻后，方可加入TEMED和過(guò)硫酸銨。一般在膠灌制后4-6分鐘，即開(kāi)始聚合，如果聚合不好，則應(yīng)使用高濃度的 TEMED和過(guò)硫酸銨。

凝膠終濃度

3 4 5 6 8 12 16 18

尿素(g) 42.0 42.0 42.0 42.0 42.0 42.0 42.0 42.0

Acr&Bis(ml) 7.5 10.0 12.0 14.5 20.0 30.0 40.0 50.0

10×TBE緩沖液(ml) 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0

雙蒸水(ml) 47.5 45.0 43.0 40.5 35.0 25.0 15.0 5.0

10%過(guò)硫酸銨(ml) 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8 0.7 0.7

TEMED(ml) 87 80 80 80 80 70 47 40

(3)膠配制好后，即可灌制膠板。一般是將凝膠沿著壓條邊緣緩慢地倒入玻璃板的槽中，倒完后，靜止放置使之聚合*。

[注意] 1、使用夾子固定玻璃板時(shí)，夾子的力量稍大一些，防止因力量不足使灌膠的過(guò)程中出現(xiàn)漏膠液現(xiàn)象。

2、灌制凝膠的過(guò)程中要嚴(yán)防產(chǎn)生氣泡，否則影響測(cè)序的結(jié)果。

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