過氧化氫酶（CAT）試劑盒說明書

過氧化氫酶（Catalase，CAT）試劑盒說明書

測定意義：

微量法 100 管/96 樣

CAT(EC 1.11.1.6)廣泛存在于動物、植物、微生物和培養細胞中，是zui主要的 H2O2 清除酶， 在活性氧清除系統中具有重要作用。

測定原理：

H2O2 在 240nm 下有特征吸收峰，CAT 能夠分解 H2O2，使反應溶液 240nm 下的吸光度隨反 應時間而下降，根據吸光度的變化率可計算出 CAT 活性。

需自備的儀器和用品：

紫外分光光度計/酶標儀、臺式離心機、可調式移液器、微量石英比色皿/96 孔板（UV 板）、 研缽、冰和蒸餾水

試劑組成和配制：

提取液：液體 100mL×1 瓶，4℃保存； 試劑一：液體 30mL×1 瓶，4℃保存； 試劑二：液體 125μL×1 瓶，4℃保存。 

粗酶液提取： 

1、細菌、細胞或組織樣品的制備

收集細菌或細胞到離心管內，離心后棄上清；按照每 500 萬細菌或細胞加入 1mL 提取液， 超聲波破碎細菌或細胞(冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復 30 次）；8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

稱取約 0.1g 組織，加入 1mL 提取液進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min，取上清，置 冰上待測。

2、血清（漿）樣品：直接檢測。

測定步驟：

1、 分光光度計或酶標儀預熱 30min 以上，調節波長至 240nm，蒸餾水調零。

2、CAT 檢測工作液的配制：用時在試劑二中加入 25mL 試劑一，充分混勻，作為工作液。

3、測定前將 CAT 檢測工作液在 37℃（哺乳動物）或 25℃（其它物種）水浴 10min 以上。

4、在微量石英比色皿或 96 孔板中加入 10μL 樣本和 190μL 工作液，立即混勻并計時，記錄

240nm 下初始吸光值 A1 和 1min 后的吸光值 A2。計算 ΔA＝A1-A2。

CAT 活性計算：

a.用微量石英比色皿測定的計算公式如下

1、血清（漿）CAT 活力的計算:

單位的定義：每毫升血清（漿）每分鐘催化 1nmol H2O2 降解定義為一個酶活力單位。

CAT(U/mL)= [ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷V 樣÷T=459×ΔA

2、組織、細菌或細胞中 CAT 活力計算：

（1）按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每 mg 組織蛋白每分鐘催化 1nmol H2O2 降解定義為一個酶活力單位。

CAT(U/mg prot)=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(V 樣×Cpr) ÷T=459×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計算：

單位的定義：每 g 組織每分鐘催化 1nmol H2O2 降解定義為一個酶活力單位。

CAT(U/g 鮮重)=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(W× V 樣÷V 樣總)÷T=459×ΔA÷W

（3） 按細菌或細胞密度計算：

單位的定義：每 1 萬個細菌或細胞每分鐘催化 1nmol H2O2 降解定義為一個酶活力單位。

CAT(U/104 cell)＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷（500×V 樣÷V 樣總）÷T =0.917×ΔA

V 反總：反應體系總體積，2×10-4 L；ε：H2O2 摩爾消光系數，4.36×104 L / mol /cm；d：比 色皿光徑，1cm；V 樣：加入樣本體積，0.01 mL；V 樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反 應時間，1 min；W：樣本質量，g；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；500：細胞或細菌總數， 500 萬。

b.用 96 孔板測定的計算公式如下

1、血清（漿）CAT 活力的計算:

單位的定義：每毫升血清（漿）每分鐘催化 1nmol H2O2 降解定義為一個酶活力單位。

CAT(U/mL)=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷V 樣÷T=918×ΔA

2、組織、細菌或細胞中 CAT 活力計算：

（1）按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每 mg 組織蛋白每分鐘催化 1nmol H2O2 降解定義為一個酶活力單位。

CAT(U/mg prot)=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(V 樣×Cpr) ÷T =918×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計算：

單位的定義：每 g 組織每分鐘催化 1nmol H2O2 降解定義為一個酶活力單位。

CAT(U/g 鮮重)=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷（W× V 樣÷V 樣總）÷T=918×ΔA÷W

（3） 按細菌或細胞密度計算：

單位的定義：每 1 萬個細菌或細胞每分鐘催化 1nmol H2O2 降解定義為一個酶活力單位。

CAT(U/104 cell)=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷（500×V 樣÷V 樣總）÷T=1.836×ΔA

V 反總：反應體系總體積，2×10-4 L；ε：H2O2 摩爾消光系數，4.36×104 L / mol /cm；d：96 孔板光徑，0.5cm；V 樣：加入樣本體積，0.01 mL；V 樣總：加入提取液體積，1 mL；T： 反應時間，1 min；W：樣本質量，g；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；500：細胞或細菌總 數，500 萬。