提取外周血淋巴細胞時注意事項

提取外周血淋巴細胞時注意事項
如果取外周血淋巴細胞 （PBMC） 進行ELISPOT檢測，采用新鮮血液。在保證無菌操作的前提下，首先應(yīng)保證取血時抗凝劑應(yīng)及時充分的與血液混勻，避免血凝塊的出現(xiàn)。抗凝血及時提取PBMC，避免放置時間過長，室溫下避免過夜。應(yīng)選用分離效果好的淋巴細胞分離液，避免PBMC中混有過多其他細胞成分或雜質(zhì)。

外周血出現(xiàn)溶血后，在使用淋巴細胞分離液分離PBMC時，溶血產(chǎn)生的細胞碎片、血紅素等雜質(zhì)將極大可能懸浮于分離液的層面，在吸取PBMC時非常容易混入這些雜質(zhì)，由于混入細胞的細胞碎片和血紅素很難清洗去除，在進行ELISPOT實驗時，有可能沉積在培養(yǎng)板底，嚴重影響細胞因子和抗體的結(jié)合，進而影響實驗結(jié)果。

分離外周血淋巴細胞適合于ELISPOT試驗方法
使用淋巴細胞分離液，推薦使用進口淋巴細胞分離液，如：Lymphoprep，或者NycoPrep 1.077（無寡糖）。避免使用紅細胞裂解液分離淋巴細胞。

從動物脾臟組織分離淋巴細胞
取動物脾臟組織時，應(yīng)注意取材的無菌操作。分離出脾臟組織，研磨后過200目篩網(wǎng)，保證所分離的細胞為單個細胞懸液。獲得細胞懸液后應(yīng)該使用相應(yīng)的淋巴細胞分離液進一步分離單個核細胞。

在ELISPOT板上，每孔我應(yīng)該放置淋巴細胞的數(shù)目
在使用ConA，PHA等陽性刺激孔中，一般放置的淋巴細胞數(shù)為 104～2×105。在使用抗原作為刺激劑的情況下，每孔細胞濃度可在1～4×105。在使用多克隆刺激劑的情況下，應(yīng)適當調(diào)低細胞濃度。但由于所用刺激劑的強度和批號不同，建議初次進行ELISPOT檢測時，對刺激劑濃度和細胞濃度設(shè)立梯度，以保證較理想的實驗結(jié)果。

對淋巴細胞進行體外刺激預(yù)孵育、或板內(nèi)同步刺激培養(yǎng)
1）將抗原和淋巴細胞在體外混合，刺激并預(yù)孵育，是通用的方法。預(yù)孵育的淋巴細胞，在置入ELISPOT板之前應(yīng)使用復(fù)溫到37℃的培養(yǎng)液清洗細胞1-2次。置入ELISPOT板以后通常在37℃培養(yǎng)5～6小時。
2）對于高度特異性抗原，可以采用將淋巴細胞和抗原同時加入ELISPOT板孔中，37℃培養(yǎng)箱中，同步進行刺激、培養(yǎng)、和細胞因子捕獲。淋巴細胞板內(nèi)同步刺激培養(yǎng)的時間通常為22～24小時。

ELISPOT試驗檢測的是每一個分泌細胞因子的活化細胞。在培養(yǎng)細胞過程中，任何移動、震動（包括開關(guān)培養(yǎng)箱門）都會導(dǎo)致細胞在培養(yǎng)板上的移動，從而得到不規(guī)則斑點或者斑點花紋，影響zui終結(jié)果。因此細胞在ELISPOT培養(yǎng)板孵育的過程中，應(yīng)注意保持培養(yǎng)板的靜置，不應(yīng)對其移動。

在使用抗原刺激淋巴細胞培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)液變黃，這種現(xiàn)象通常見于使用很強的多克隆抗原刺激淋巴細胞，某些多克隆抗原會導(dǎo)致淋巴細胞凋亡或者死亡，大量淋巴細胞死亡后使培養(yǎng)液變黃。使用這些淋巴細胞進行后續(xù)ELISPOT試驗通常得到很低的斑點（SPOT）形成。換用特異性抗原后可以避免該現(xiàn)象。

在ELISPOT結(jié)果中出現(xiàn)不規(guī)則的大塊斑點，有的區(qū)域沒有斑點的原因，不規(guī)則斑點區(qū)域的出現(xiàn)一般是細胞分離不*所至，有時候采用多克隆抗原孵育的淋巴細胞也會產(chǎn)生成團現(xiàn)象。請確認加入到ELISPOT板中進行孵育的是單細胞懸液。

使用開口較大的吸頭，動作輕柔，避免對細胞的吹打，減少剪切力對淋巴細胞的傷害。