電化學發光免疫測定

電化學發光免疫測定（electrochemiluminescence immunoassay，ECLl）是電化學發光（ECL）和免疫測定相結合的產物。ECLI中標記物的發光原理與一般的化學發光（CL）不同，是一種在電極表面由電化學引發的特異性化學發光反應，實際上包括了電化學和化學發光2個過程。ECL與CL的差異在于ECL是電啟動發光反應，而CL是通過化合物混合啟動發光反應。在中應用的標記物為電化學發光反應的底物三聯吡啶釕，其衍生物N—羥基琥珀酰胺（NHS）酯可通過化學反應與抗體或不同化學結構的抗原分子結合，制成標記的抗體或抗原。ECLI的測定模式與ELISA相似，分2個步驟進行。現以雙抗體夾心法測定TSH抗原為例介紹ECLI反應原理。

第l步：耦聯有活化的三聯吡啶釕衍生物即[Ru（bpy）3]2+N—羥基琥珀酰胺酯（NHS）的TSH抗體和結合了*的TSH抗體與待測血清同時加入一個反應杯中孵育。

第2步：將被鏈霉親和素包被的磁珠加入反應杯中，再次孵育，使*與親和素的結合，將磁珠、TSH抗體連接為一體，形成雙抗體夾心。

第3步，蠕動泵將形成的[Ru（bpy）3]2+抗體—抗原—抗體—磁珠復合體吸人流動測量室，此時，磁珠被工作電極下面的磁鐵吸附于電極表面。同時，游離的TSH抗體（與*結合的和與[Ru（bpy）3] 2+結合的抗體）也被吸出測量室。

緊接著，蠕動泵加入含三丙胺（TPA）的緩沖液，同時電極加電壓，啟動ECL反應過程。發光劑[Ru（bpy）3]2+和電子供體TPA在陽極表面，可同時各失去一個電子而發生氧化反應，使2價的[Ru（bpy）3] 2+被氧化成3價，后者是一種強氧化劑；另一方面，TPA被氧化成陽離子自由基TPA…，后者很不穩定，可自發失去1個質子（H+），形成自由基TPA·，這是一種很強的還原劑，可將1個電子給3價的[Ru（bpy）3）3] 2+，使其形成激發態的[Ru（bpy）32+，而TPA自身被氧化成二丙胺和丙醛。激發態的[Ru（bpy）3] 2+通過熒光衰減機制，發射出一個波長620nm的光子，重新生成基態的[Ru（bpy）3] 2+。該過程在電極表面周而復始地進行，產生許多光子，光電倍增管檢測光強度，光強度與[Ru（bpy）3] 2+的濃度呈線性關系，故可測出待測抗原的含量。

ECLI具有以下優點：①標記物可再循環利用，使發光時間更長，強度更高，易于測定；②敏感度高，可達pg/ml或pmol水平；③線性范圍寬，可達>104單位；④反應時間短，20min以內可完成測定；⑤試劑穩定性好，2～5℃可保持1年以上。目前ECLI不 僅可以應用于所有的免疫測定，而且還可用于DNA／RNA探針的檢測。