小量全血DNA提取方法

小量全血DNA提取方法

儲(chǔ)存事項(xiàng):
1. 結(jié)合液CB或者抑制物去除液IR低溫時(shí)可能出現(xiàn)析出和沉淀，可以在37℃水浴幾分鐘幫助重新溶解，恢復(fù)澄清透明后冷卻到室溫即可使用。
2. 為避免降低活性，方便運(yùn)輸，提供蛋白酶K為凍干粉狀，收到后，可短暫離心后，加入1毫升滅菌水溶解。因?yàn)榉磸?fù)凍融可能會(huì)降低酶活性，因此溶解后立即按照每次使用量（20微升）分裝凍存，－20℃保存。
3. 避免試劑長(zhǎng)時(shí)間暴露于空氣中發(fā)生揮發(fā)、氧化、pH值變化，各溶液使用后應(yīng)及時(shí)蓋緊蓋子。
? 操作步驟：（實(shí)驗(yàn)前請(qǐng)先閱讀注意事項(xiàng)）
提示：*次使用前請(qǐng)先在漂洗液WB中加入量無(wú)水乙醇，充分混勻，加入后請(qǐng)及時(shí)在方框打鉤標(biāo)記已加入乙醇，以免多次加入!
1. 取200ul新鮮、冷凍或加入各種抗凝劑的血液，放入1.5ml離心管。
如果全血起始量小于200μl，則用緩沖液BB補(bǔ)足到200μl。如果起始量介于200μl-300μl之間，則后續(xù)操作需要按照比例增加試劑用量。如果起始量介于300μl-1ml之間，則需要*行紅細(xì)胞裂解操作（見(jiàn)本說(shuō)明書(shū)后附錄）。
2. 加入20μl蛋白酶K （20mg/ml）溶液，充分混勻，再加入200μl結(jié)合液CB，立刻渦旋振蕩充分混勻，在70℃放置10分鐘。溶液應(yīng)變清亮（但顏色偏黑色）。
可選步驟，一般不需要: 如果RNA殘留較多，需要去除RNA，可以在加入200μl 結(jié)合液CB 前加20μl RNase A（25mg/ml）溶液，振蕩混勻，室溫放置5-10分鐘。
3. 冷卻后加入100μl 異丙醇，立刻渦旋振蕩充分混勻，此時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)絮狀沉淀。
上述步驟中立刻渦旋或者吹打充分混勻非常重要，混勻不充分嚴(yán)重降低產(chǎn)量，必要時(shí)如樣品粘稠不易混勻時(shí)可以渦旋振蕩15秒混勻。
4. 將上一步混合物（包括可能有的沉淀）加入一個(gè)吸附柱AC中，（吸附柱放入收集管中）13,000 rpm離心30-60秒，倒掉收集管中的廢液。
5. 加入500μl抑制物去除液IR，12,000 rpm 離心30秒，棄廢液。
6. 加入700μl漂洗液WB（請(qǐng)先檢查是否已加入無(wú)水乙醇!），12,000 rpm 離心30秒，棄掉廢液。
7. 加入500μl漂洗液WB，12,000 rpm 離心30秒，棄掉廢液。
8. 將吸附柱AC放回空收集管中，13,000 rpm離心2分鐘，盡量除去漂洗液， 以免漂洗液中殘留乙醇抑制下游反應(yīng)。
9. 取出吸附柱AC，放入一個(gè)干凈的離心管中，在吸附膜的中間部位加100μl洗脫緩沖液EB（洗脫緩沖液事先在 65-70℃水浴中預(yù)熱效果更好）， 室溫放置3-5分鐘，12,000 rpm 離心1分鐘。將得到的溶液重新加入離心吸附柱中，室溫放置2分鐘，12,000 rpm離心1分鐘。
洗脫體積越大，洗脫效率越高，如果需要DNA濃度較高，可以適當(dāng)減少洗脫體積， 但是zui小體積不應(yīng)少于50μl，體積過(guò)小降低DNA洗脫效率，減少DNA產(chǎn)量。
10. DNA可以存放在2-8℃，如果要長(zhǎng)時(shí)間存放，可以放置在－20℃。
? 附錄（以300μl，1ml全血舉例紅細(xì)胞裂解操作）：
1. 吸取900μl紅細(xì)胞裂解液到一個(gè)1.5ml離心管或者3ml紅細(xì)胞裂解液到一個(gè)15ml離心管。（紅細(xì)胞裂解液可向本公司購(gòu)買(mǎi)）
2. 將抗凝全血（使用前回復(fù)到室溫）顛倒混勻后，吸取300μl全血和1ml全血分別加到上述1.5ml和15ml離心管中，顛倒6-8次，并倒置輕彈管壁，確保充分混勻。
3. 室溫放置10分鐘（期間應(yīng)該顛倒輕彈混勻數(shù)次，幫助裂解紅細(xì)胞）。
4. 12,000 rpm離心20秒（對(duì)于1.5ml離心管）或2,000-3,000 rpm離心5分鐘（對(duì)于15ml離心管），倒棄紅色上清，并小心的盡可能多的吸棄上清（注意不要吸到管底的細(xì)胞團(tuán)），留下完整的管底白細(xì)胞團(tuán)和大約10μl的殘留上清。
離心后在管底應(yīng)該見(jiàn)到白色的白細(xì)胞團(tuán)，也可能有一些紅細(xì)胞殘片和白細(xì)胞團(tuán)在一起，但是如果看到的是大部分的紅色細(xì)胞團(tuán)，說(shuō)明紅細(xì)胞裂解很不充分，應(yīng)該再加入紅細(xì)胞裂解液重懸細(xì)胞團(tuán)后重復(fù)步驟3，4。
5. 加入200μl緩沖液BB渦旋振蕩重懸白細(xì)胞團(tuán)，充分分散白細(xì)胞團(tuán)。
其中由于肝素抗凝血的白細(xì)胞沉淀團(tuán)很難打散重懸，影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)裂解效果，建議選用非肝素的抗凝劑收集血液標(biāo)本。