原代細(xì)胞核基質(zhì)的制備

原代細(xì)胞核基質(zhì)的制備 

試劑和器材：
1. 硫酸銨（含10mmol/L Tris-HCl，（pH7.4）及0.2mmol/L MgCl2的1mol/L與0.2mol/L硫酸銨溶液）；
2. 氯化鎂（1mol/L儲(chǔ)存液）；
3. 苯甲基磺酰氟（PMSF）（無水乙醇配制的1mol/L儲(chǔ)存液）；
4. 純化的細(xì)胞核保存于含0.25mol/L蔗糖、10mmol/L Tris-HCl，（pH7.4）、5mmol/L MgCl2的溶液中；
5. DNA酶Ⅰ；
6. Tris-HCl（1mol/L儲(chǔ)存液，pH7.4）；
7. 懸浮緩沖液（SB）：5mmol/L MgCl2、10mmol/L Tris-HCl，pH7.4（含0.1mmol/L苯甲基磺酰氟）；
8. Triton X-100；
9. 低速離心機(jī)，配有固定角轉(zhuǎn)子和離心管；

實(shí)驗(yàn)方法：
所有的試劑置于0—4℃，并且所有操作均在0—4℃完成。
1. 向核懸液中加入Triton X-100使其濃度達(dá)到1%（體積分?jǐn)?shù)），孵育30min同時(shí)用移液器小心混勻，以免產(chǎn)生氣泡；
2. 1000g離心10min，棄去上清。用懸浮緩沖液小體積重懸提取的核沉淀（如5ml）；
3. 用DNA酶Ⅰ（30U/mg　DNA）消化細(xì)胞核30min；
4. 通過緩慢添加1mol/L硫酸銨溶液來增加鹽濃度，使其zui終離子強(qiáng)度達(dá)到0.6（0.2mol/L 硫酸銨），加入0.2mol/L硫酸銨使體積達(dá)到40ml，然后孵育30min；
5. 1000g離心15min沉淀核基質(zhì)，棄去上清；
6. 用懸浮緩沖液重懸沉淀，用相差顯微鏡或薄片電鏡檢測獲得的產(chǎn)物；