真菌檢驗技術(shù)的進(jìn)步

真菌檢驗的臨床重要性日益增加。傳統(tǒng)的真菌培養(yǎng)和鑒定技術(shù)需時較長，且深圳特區(qū)部真菌感染的病原菌常不易培養(yǎng)成功，成為實驗診斷的難點。
近年來，真菌感染的快速實驗診斷技術(shù)正在努力解決這一問題。一、應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)自臨床標(biāo)本中檢出真菌DNA；二、應(yīng)用單抗和免疫學(xué)技術(shù)自臨床標(biāo)本中快速檢出真菌抗原；三、利用真菌的特異性酶快速診斷真菌；四、常規(guī)培養(yǎng)與鑒定技術(shù)的進(jìn)步，現(xiàn)分述如下。

一、 常規(guī)分離、鑒定技術(shù)的進(jìn)步
利用酵母樣真菌在生長過程中形成的酶，作用于培養(yǎng)基中的色原底物，使菌落呈現(xiàn)不同的顏色，此種CHROMO AGAR的應(yīng)用，利于快速分離與初步鑒定酵母樣真菌。
酵母菌的常用鑒定系統(tǒng)已有以AP120C為代表的手工法，以ATB32C為代表的半自動法，以AMS（vitek,vitek 2）為代表的自動代法借助于AMS的YBC卡的生化反應(yīng)，應(yīng)用人工雙歧層次分析鑒定法（Dendrogram Hierarchy Process Analytic identification Method,DHPA）可使鑒定正確率提高。
利用酵母菌生長過程中形成的予成酶（Preformed Enzymes）作用于合成的色原底物而制成的成套微量鑒定系統(tǒng)Rap ID Yeast plus System（RYP,美國Innovative Diagnostic System公司），可于4小時完成酵母菌的快速鑒定，與應(yīng)用API20C的一致率達(dá)97.3%。
平滑念株菌可利用其快速分解菌藻糖（Trehalose）而迅速鑒定。用4%菌藻糖的0.1μmol/L枸櫞酸緩沖液，取待鑒定菌落濃涂入液中，37℃溫育3h，以尿葡萄糖試紙檢測，如在2分鐘內(nèi)顯色（陽性）即為平滑念珠菌。經(jīng)與傳統(tǒng)鑒定方法比較，此法的敏感性98.8%,特異性99.1%.
都柏林念珠菌的臨床重要性在增長，其簡易可靠的鑒定試驗為該菌在42℃不能生長，且β-D葡萄苷酶為陰性。
二、 自臨床標(biāo)本中直接檢查抗原
深部真菌感染者血中難于培養(yǎng)出菌體，尤其是絲狀真菌菌體常粘附、纏繞于組織，血中不易出現(xiàn)。但組織中菌體可溶性抗原可吸收入血自血、尿或感染組織液中直接檢查真菌抗原為快速診斷的重要手段；雖也可檢查抗體，但難達(dá)快速診斷。
（一）、檢測念球菌屬的甘露聚糖及其抗原
1．膠乳凝集試驗（Sanofi Diagnostics Pasteur公司）
取300μl血清，加100μlEDTA處理液，混勻，煮沸3min，離心10000×g10min，取上清40μl加10μlSanofi膠乳粒子，3min內(nèi)出現(xiàn)凝集為陽性。
2． EIA法。以單抗包被酶標(biāo)板，用雙抗體夾心法檢查血清中念球菌抗原（Behring Diagrostics公司試劑）
3．檢測血中的白色念球菌的甘露聚糖抗體。ENA法檢查中甘露聚糖對念珠菌感染的診斷敏感性40%，特異性98%，ENA法檢查甘露聚糖抗體對念珠菌感染的診斷敏感性53%,特異性94%。
4．檢查血清中D-阿拉醇或D-阿拉伯醇與L-阿拉伯醇的比值可快速診斷念珠菌病。Yeo等用基因重組的D-阿拉伯醇脫氫酶以酶熒光法定量，發(fā)現(xiàn)念珠菌感染者血清中來自菌體的D-阿拉伯醇明顯升高，用此法迅速論斷新生兒的侵襲性念珠菌病。
Mitsutake等比較了自39名深部念珠菌病患者血液中檢出抗原的四種方法。應(yīng)用斑點印跡法檢查其烯醇化酶（Enlase）抗原的陽性率71.8%，特異性；應(yīng)用膠乳凝集檢查熱敏性糖蛋白抗原陽性率76.9%，特異性87.5%；應(yīng)用膠乳凝集檢查甘聚糖抗原陽性率75.6%，特異性，應(yīng)用鱟試試驗檢查細(xì)胞壁組分β-Glucan的陽性率84.4%，特異性87.5%。
（二）、肺曲菌病的血清抗原檢查
1．膠乳凝集試驗（Pastorex Aspergillus,法國Sanofi公司）檢查血清中半乳甘露聚糖（Galactomannan）。方法如上述膠乳凝集試驗。
2．單抗ELISA法檢查血清中半乳甘露聚糖抗原（法國Sanofi公司），敏感性達(dá)1.0ng/ml。
3． DELFIA法。Eu標(biāo)記的時間分辨熒光分析法（芬蘭Wallac公司試劑）敏感性達(dá)0.5ng/ml。
（三）、血清中查組織胞漿菌抗原
以此菌莢膜的69-70kd抗原制出單抗以ELISA法檢出可及時明確診斷。
（四）、尿中檢查馬尼菲青霉菌抗原
以該菌外壁的膜蛋白為抗原制出單抗，以ENA法診斷33例患者，52例健康人和248例無真菌感染的住院患者均為陰性。本法的特異性98%，敏感性97%，陽性予示值84%，陰性予示值99.7%。
（五）、新形隱球菌的抗原檢查
新形隱球菌具有莢膜多糖抗原，可以單抗致敏的膠乳凝集試驗快速檢出。其莢膜多糖的主要成分為Glucuronoxylomannan，以此抗原的單抗包被酶標(biāo)板，以雙抗體夾心法檢出抗原，血清稀釋1：8為陽性。Feldmesset用此法自AIDS患者引發(fā)新形隱球菌性腦膜炎的血清中檢出抗原而及時診斷。
（六）、深部絲狀真菌感染的抗原檢查。
絲狀真菌的細(xì)胞壁成分含（1→3）β-D葡聚糖，可用鱟試劑（鱟凝固酶）檢出。以20μg/ml為界限值。文獻(xiàn)報告檢查41例深部絲狀真菌感染者，37例陽性，敏感率90%，特異性。
三、 檢查真菌的特異性酶
白色念珠菌具N-乙酰-β-D半乳糖苷酶和*氨肽酶，如用適當(dāng)?shù)孜餀z測，此兩酶同時陽性，即可確定。都柏林念珠菌只具N-乙酰-β-D半乳糖苷酶。克柔念珠菌具酸性磷酸酶，熱帶念珠菌具吡咯磷酸酶，平滑、副平滑念珠菌具β-D半乳糖苷酶，新形隱球菌具酚氧酶，均可用適當(dāng)呈色底物快速完成鑒定。
四、 分子生物學(xué)技術(shù)
（一）、用PCR等技術(shù)字標(biāo)本中擴增真菌DNA。國內(nèi)應(yīng)用PCR與反向斑點雜交快速檢測及鑒定念珠菌主要種別。國外可以用PCR-DEIA技術(shù)從血清中擴增出白色念珠菌的DNA來診斷念珠菌病。
針對真菌的共同序列而設(shè)計的‘引物’（pan-primer）而擴增580bp的產(chǎn)物，為真菌所共有。檢測血液標(biāo)本即可明確體內(nèi)有無真菌感染。
（二）、用于真菌的型別分析。國內(nèi)應(yīng)用隨機引物PCR擴增后進(jìn)行真菌分型，結(jié)果可靠。應(yīng)用隨機引物擴增物多態(tài)性分析（RAPD）可以將5種曲霉菌鑒別開（煙、黃、黑、土、構(gòu)巢曲霉）。國外結(jié)合PCR與酶標(biāo)記探針在紙條上進(jìn)行檢測（LiPA,line probe assay）可鑒別出主要的致病性真菌。
（三）、檢出念珠菌的基因變異快速確定念珠菌對*的耐藥性。此種耐藥性由基因的1554T突變?yōu)镃而致，應(yīng)用Lightcycler儀器，以熒光共振能量轉(zhuǎn)移和基因片段溶解溫度曲線技術(shù)測定。