免疫組織化學(xué)方法

1、基本原理

　　酶標(biāo)抗體技術(shù)是通過共價(jià)鍵將酶連接在抗體上，制成酶標(biāo)抗體，再借酶對(duì)底物的特異催化作用，生成有色的不溶性產(chǎn)物或具有一定電子密度的顆粒，于普通顯微鏡或電鏡下進(jìn)行細(xì)胞表面及細(xì)胞內(nèi)各種抗原成分的定位，根據(jù)酶標(biāo)記的部位可將其分為直接法（一步法）、間接法（二步法）、橋聯(lián)法（多步法）等，用于標(biāo)記的抗體可以是用免疫動(dòng)物制備的多克隆抗體或特異性的單克隆抗體，是特異性強(qiáng)的價(jià)的單克隆抗體。直接法是將酶直接標(biāo)記在*抗體上，間接法是將酶標(biāo)記在第二抗體上，檢測(cè)組織細(xì)胞內(nèi)的特定抗原物質(zhì)。目前通常選用免疫酶組織化學(xué)間接染色法。

　　（1）標(biāo)本的制備和處理

用于酶標(biāo)抗體組化技術(shù)的標(biāo)本有組織切片（冷凍切片和石蠟切片）、組織壓印片。標(biāo)本的制作和固定與熒光抗體技術(shù)相同，但尚需要一些特殊處理。

　?。?）標(biāo)記酶

　　用于標(biāo)記的酶應(yīng)具備以下幾點(diǎn)：

　　① 酶催化的底物必須是特異的，且容易被顯示，所形成的產(chǎn)物易于在光鏡或電鏡下觀察。

　　② 所形成的終產(chǎn)物沉淀必須穩(wěn)定，即終產(chǎn)物不能從酶活性部位向周圍組織彌散，影響組織學(xué)定位。

　　③ 較易獲得的酶分子，有商品出售。

　　④ 中性 pH 時(shí)，酶應(yīng)穩(wěn)定，酶標(biāo)記抗體后，保存 1-2 年活性不應(yīng)改變，且酶的催化活性（ Turnover ）越高越好。

　?、?酶標(biāo)過程中，酶與抗體連接，不能影響二者的活性。

　?、?被檢測(cè)組織中，不應(yīng)存在與標(biāo)記酶相同的內(nèi)源性酶或類似物質(zhì)。

　　其中 ① 、② 兩點(diǎn)zui重要，因?yàn)槿菀罪@示的酶并非均能形成不可溶性的復(fù)合物。一般認(rèn)為，辣根過氧化物酶（HRP）較佳，是zui常用的一種酶。

　　除 HRP 外，堿性磷酸酶（ALP）和葡萄糖氧化酶（GOD）也較常用。

　　（3）底物顯色劑

　?、?DAB （3，3-二氨基聯(lián)苯胺）：顯色后陽性反應(yīng)產(chǎn)物呈棕褐色。

　?、?AEC （3，氨基-9- 乙基卡巴唑）：顯色后陽性反應(yīng)產(chǎn)物呈紅色或紫紅色。

　　2、以 PRRSV 為例介紹一下染色程序。

　?。?）切片準(zhǔn)備：將低溫保存的切片37 ℃預(yù)熱 5分鐘 。

　　（2）常規(guī)脫蠟： 二甲苯15分鐘； 乙醇 5分鐘；乙醇1分鐘；90% 乙醇 1分鐘；75% 乙醇 1分鐘。

　?。?）抑制內(nèi)源酶：1% 鹽酸酒精（75% 乙醇 99mL 加 1mL 鹽酸）作用10分鐘； 3%過氧化氫水溶液作用15分鐘。

　?。?）蒸餾水洗 2 次。

　?。?）用 0.05% *37 ℃消化2分鐘。

　　（6）PBS洗2次，擦干周圍后用組化（蠟）筆沿切片周邊畫一個(gè)圈 。

　?。?）封閉：正常馬血清1：20倍稀釋， 37 ℃ 孵育20分鐘。

　　（8）加一抗（1 : 800倍稀釋的PRRSV單克隆抗體 Mab 11），37 ℃孵育1小時(shí)或37 ℃孵育0.5小時(shí)后4 ℃過夜。對(duì)照片不加一抗。

　?。?）PBS 洗 3 次。

　　（10）加二抗（HRP 標(biāo)記的羊抗鼠 IgG 1 : 100X 稀釋）37 ℃孵育1小時(shí)。

　?。?1）PBS洗3 次。

　?。?2）加AEC顯色5~10分鐘。

　?。?3）蘇木素襯染10秒鐘。

　?。?4）自來水洗2分鐘。

　?。?5）待切片自然干燥后用水溶性封片劑封片。

　?。?6）鏡檢、觀察記錄結(jié)果。