免疫細胞化學技術

免疫細胞化學技術
一、的概述
*免疫細胞化學（immunocytochemistry, ICC）
-是利用抗原與抗體特異性結合的原理，通過化學反應使標記抗體的顯色劑 （熒光素、酶、金屬離子、同位素） 顯色來確定細胞內抗原的成分（主要是多肽和蛋白質），對其進行定位、定性及定量的研究，稱為～。
（一） 對抗原和抗體的要求
*具有特異性高和親和力強的抗體是實驗成功的首要條件。
-對抗體的要求：純度高、比活性強；
*高度特異性抗體的獲得，取決于抗原的純度。
-對抗原的要求：純度高，免疫原性強，穩定無變化。
（二） 抗原 （antigen, Ag）
*抗原的概念：凡是在機體內引起體液免疫和（或）細胞免疫反應的物質，稱為抗原?？乖哂袃蓚€方面的特性：
-免疫原性：引起機體產生抗體和（或）致敏淋細胞的特性；
-免疫反應性：抗原能與相應的抗體及致敏淋巴細胞發生特異的結合或反應的特性。
*根據抗原是否顯示免疫原性分為：
-*抗原：分子量較大，一般在10kDa以上，并具有較復雜的化學組成。
*免疫原性zui強的是蛋白質抗原，多糖次之；脂類和核酸必需和蛋白質及多糖形成復合物才具有良好的免疫原性。
-半抗原：又稱為不*抗原，分子量較小。例如：某些短肽、多糖、類脂和藥物等。
*半抗原必需與載體結合，才能獲得免疫原性。
載 體
*通常是具有高度免疫原性的大分子物質，具有將免疫原性傳遞給耦聯的半抗原能力。
-常用的載體有鑰孔血藍蛋白（keyhole limpet hemocyanin，KLH）、牛血清白蛋白（bovine
serum albumin, BSA）、卵白蛋白（Ovalbumin，OVA）等。
-用戊二醛或碳化二亞胺作為交聯劑通過功能基團-NH2、-COOH等將半抗原結合到載體上。結合比例為5kDa結合5～25個分子的小肽。
（三）抗體 （antibody, Ab）
1、抗體的概念：
*機體受到抗原刺激后，由漿細胞合成并分泌出一類具有與抗原發生特異性結合的球蛋白，被稱為抗體。
-抗體主要存在于血清內；
-抗體都是免疫球蛋白，但免疫球蛋白并不一定都是抗體。
-免疫球蛋白根據重鏈的結構及抗原特異性不同分為五種，既IgG、 IgD、IgE、 IgA、IgM。
2、免疫組化實驗中常用的抗體：單克隆抗體和多克隆抗體。
*單克隆抗體：是一個B淋巴細胞克隆分泌的抗體，是應用細胞融合雜交瘤技術免疫動物制備的。
-特異性強、抗體產量高。
*多克隆抗體：是將純化后的抗原直接免疫動物后，從動物血中所獲得的免疫血清，是多個B淋巴細胞克隆所產生的抗體混合物。
-特異性低，會產生抗體的交叉反應。
-多克隆抗體廣泛應用于石蠟包埋組織切片，可減少假陰性染色機會。
-抗原與抗體的結合，要求量保持一定比例，當抗原或抗體過量時，是不能聚合成大顆粒。
3、抗體的制備——多克隆抗體的制備
*動物的選擇
*佐劑（adjuvant）
*免疫方法
*免疫劑量
*抗體效價的測定
*放血或定期抽血