斑點酶聯(lián)免疫吸附測定材料和方法

斑點酶聯(lián)免疫吸附測定法（DoISA,DELISA）是以纖維素膜代替免疫酶固相載體法中常用的聚苯乙烯微量反應(yīng)板而建立的一種免疫檢驗方法。DELISA不僅保留了常規(guī)ELISA的優(yōu)點，而且還彌補(bǔ)了抗原或抗體對載體包被不牢等不足，所以具有敏感性高，特異性強(qiáng)，被檢樣品用量少，節(jié)省材料，不需特殊儀器，結(jié)果判定簡單易行和便于長期保存等特點。因此，該法自問世以來，以其*的優(yōu)勢，廣泛應(yīng)用于抗原抗體的檢測和雜交瘤細(xì)胞的篩選等。
DELISA的基本原理與常規(guī)ELISA和免疫酶染色法基本相同，即將抗原或抗體首先吸附在纖維素薄膜（如硝酸纖維素膜，NC）表面，并保持其免疫活性，通過與相應(yīng)的抗體或抗原和酶標(biāo)記物的一系列免疫反應(yīng)，形成酶標(biāo)記抗原抗體復(fù)合物，在底物的參與下，結(jié)合物上的酶催化底物使其水解、氧化成另一種帶色物質(zhì)，沉著于抗原抗體復(fù)合物吸附的部位，呈現(xiàn)出肉眼可見的顏色斑點。試驗的結(jié)果可通過顏色斑點的出現(xiàn)與否和色澤深度進(jìn)行判定。DELISA常用的檢測方法有直接法、間接法、雙抗體夾心法、雙夾心法和競爭法等。

1 材料
（1） 載體：硝酸纖維素膜022～045μm,Schleiche & Schucll或國產(chǎn)；混合硝酸纖維素膜022μm，上海醫(yī)藥工業(yè)研究院生產(chǎn)。
（2） 保溫液及洗滌液：保溫液為含01%BSA、005%Tween20 PBS（001mol/L,pH值74）；洗滌液為005%Tween20 PBS。
（3） 封閉劑：含1%BSA或4%蛋清或3%白明膠的PBS。
（4） 口蹄疫單抗：口蹄疫病毒A型單克隆抗體（AFMcAb）、O型多克隆抗體（OFPcAb，由O型標(biāo)準(zhǔn)病毒免疫BALB/c鼠制得），由新疆畜牧*獸醫(yī)研究所提供。
（5） A、O、C、ZB型口蹄疫標(biāo)準(zhǔn)抗原：由蘭州獸醫(yī)研究所提供。
（6） 凍干辣根過氧化物酶標(biāo)記兔抗BALB/c鼠抗體：衛(wèi)生部生物制品研究所生產(chǎn)。
（7） 底物溶液：3,3二氨基聯(lián)苯胺50mg,005mol/L、pH值76 TrisHCl
緩沖液100ml，溶解后過濾，4℃避光保存。臨用前按003%加入H2O2。
（8） 被檢抗原的制備：水皰液可直接點樣。水皰皮用生理鹽水洗凈，晾干，稱重，剪碎，加中性玻璃砂研磨，用生理鹽水制成1∶5～1∶10懸液，室溫浸泡2h，振搖后，1 500～2 000 r/min離心10min，上清液即可用于點樣。

2 方法
DELISA間接法程序
（1） 壓跡：根據(jù)樣品的數(shù)量剪取一片硝酸纖維素膜或混合纖維素膜。用直徑3～5mm圓形打孔
器（瓊脂平板打孔器），在膜的光滑面按順序壓上痕跡，作為點樣部位。將膜置蒸餾水中浸泡，待*浸濕后，取出室溫自然干燥。
（2） 點樣：用微量移液器分別吸取1～2μl（或用玻璃棒、毛細(xì)管蘸一滴）被檢抗原液，滴于
圓圈內(nèi)，自然干燥。為增加抗原吸附量，也可在點樣干燥后，再進(jìn)行第二次點樣。同時作陰、陽性抗原對照。
（3） 封閉：將膜置平皿或小池內(nèi)，加入封閉劑，37℃浸泡30～60min。取出稍置片刻，用洗液漂洗2次，晾干。
（4） 與AFMcAb或OFPcAb反應(yīng)：用保溫液對AFMcAb或OFPcAb作適當(dāng)稀釋，加入反應(yīng)池中，于37℃覆蓋膜2h。
（5） 洗滌：用洗滌液漂洗膜3次，每次3min，晾干。
（6） 與酶結(jié)合物反應(yīng)：凍干辣根過氧化物酶標(biāo)記兔抗BALB/c鼠抗體用保溫液作1∶80稀釋，37℃覆蓋膜1h。
（7） 洗滌：3次，方法同上。
（8） 顯色：將膜浸入底物溶液中，避光染色5～15min。
（9） 終止反應(yīng)：用蒸餾水漂洗濾膜，晾干。

3 結(jié)果判定
在陰、陽對照正常情況下，以在膜圓圈內(nèi)出現(xiàn)棕色斑點為陽性，無色為陰性。膜干燥后，可長期保存。 在應(yīng)用DELISA間接法、雙抗體夾心法等檢測方法時，如果膜上包被的是已知的標(biāo)準(zhǔn)抗原或抗體，而不是被檢樣品，為了操作方便，可將上述的“診斷膜”按壓跡剪成小片，置微量反應(yīng)板的小孔中。在微孔中，“診斷膜”與相應(yīng)的被檢樣品和診斷液發(fā)生一系列的抗原抗體反應(yīng)和酶促反應(yīng)。在試驗中，被檢樣品和診斷液的用量均為每孔50μl，其他反應(yīng)條件和操作法與常規(guī)ELISA相同。

4 注意事項
1 點樣量不易過大，以免溢出壓跡圈外，造成各樣品混合，如要增加樣品吸附量，可在一次點樣干燥后，再進(jìn)行第2次點樣。
2 膜包被后，一定要封閉確實，防止抗原或抗體的非特異性吸附，避免膜本底染色過深。
3 結(jié)果判定時，應(yīng)與陰、陽性對照斑點反復(fù)比較，盡量克服肉眼觀察所帶來的誤差。