免疫細胞化學(xué)技術(shù)

免疫細胞化學(xué)技術(shù)
一、的概述
*免疫細胞化學(xué)（immunocytochemistry, ICC）
-是利用抗原與抗體特異性結(jié)合的原理，通過化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記抗體的顯色劑 （熒光素、酶、金屬離子、同位素） 顯色來確定細胞內(nèi)抗原的成分（主要是多肽和蛋白質(zhì)），對其進行定位、定性及定量的研究，稱為～。
（一） 對抗原和抗體的要求
*具有特異性高和親和力強的抗體是實驗成功的首要條件。
-對抗體的要求：純度高、比活性強；
*高度特異性抗體的獲得，取決于抗原的純度。
-對抗原的要求：純度高，免疫原性強，穩(wěn)定無變化。
（二） 抗原 （antigen, Ag）
*抗原的概念：凡是在機體內(nèi)引起體液免疫和（或）細胞免疫反應(yīng)的物質(zhì)，稱為抗原。抗原具有兩個方面的特性：
-免疫原性：引起機體產(chǎn)生抗體和（或）致敏淋細胞的特性；
-免疫反應(yīng)性：抗原能與相應(yīng)的抗體及致敏淋巴細胞發(fā)生特異的結(jié)合或反應(yīng)的特性。
*根據(jù)抗原是否顯示免疫原性分為：
-*抗原：分子量較大，一般在10kDa以上，并具有較復(fù)雜的化學(xué)組成。
*免疫原性zui強的是蛋白質(zhì)抗原，多糖次之；脂類和核酸必需和蛋白質(zhì)及多糖形成復(fù)合物才具有良好的免疫原性。
-半抗原：又稱為不*抗原，分子量較小。例如：某些短肽、多糖、類脂和藥物等。
*半抗原必需與載體結(jié)合，才能獲得免疫原性。
載 體
*通常是具有高度免疫原性的大分子物質(zhì)，具有將免疫原性傳遞給耦聯(lián)的半抗原能力。
-常用的載體有鑰孔血藍蛋白（keyhole limpet hemocyanin，KLH）、牛血清白蛋白（bovine
serum albumin, BSA）、卵白蛋白（Ovalbumin，OVA）等。
-用戊二醛或碳化二亞胺作為交聯(lián)劑通過功能基團-NH2、-COOH等將半抗原結(jié)合到載體上。結(jié)合比例為5kDa結(jié)合5～25個分子的小肽。
（三）抗體 （antibody, Ab）
1、抗體的概念：
*機體受到抗原刺激后，由漿細胞合成并分泌出一類具有與抗原發(fā)生特異性結(jié)合的球蛋白，被稱為抗體。
-抗體主要存在于血清內(nèi)；
-抗體都是免疫球蛋白，但免疫球蛋白并不一定都是抗體。
-免疫球蛋白根據(jù)重鏈的結(jié)構(gòu)及抗原特異性不同分為五種，既IgG、 IgD、IgE、 IgA、IgM。
2、免疫組化實驗中常用的抗體：單克隆抗體和多克隆抗體。
*單克隆抗體：是一個B淋巴細胞克隆分泌的抗體，是應(yīng)用細胞融合雜交瘤技術(shù)免疫動物制備的。
-特異性強、抗體產(chǎn)量高。
*多克隆抗體：是將純化后的抗原直接免疫動物后，從動物血中所獲得的免疫血清，是多個B淋巴細胞克隆所產(chǎn)生的抗體混合物。
-特異性低，會產(chǎn)生抗體的交叉反應(yīng)。
-多克隆抗體廣泛應(yīng)用于石蠟包埋組織切片，可減少假陰性染色機會。
-抗原與抗體的結(jié)合，要求量保持一定比例，當(dāng)抗原或抗體過量時，是不能聚合成大顆粒。
3、抗體的制備——多克隆抗體的制備
*動物的選擇
*佐劑（adjuvant）
*免疫方法
*免疫劑量
*抗體效價的測定
*放血或定期抽血