PCR實用技巧

增加PCR的特異性：
1. primers design
這是zui重要的一步。理想的，只同目的序列兩側的單一序列而非其他序列退火的引物要符合下面的 一些條件
a. 足夠長,18-24bp,以保證特異性.當然不是說越長越好,太長的引物同樣會降低特異性,并且降低產量
b. GC% 40%~~~~60%     c. 5'端和中間序列要多GC,以增加穩定性
d. 避免3'端GC rich, zui后3個BASE不要有GC,或者zui后5個有3個不要是GC
e. 避免3'端的互補, 否則容易造成DIMER   f. 避免3'端的錯配    g. 避免內部形成二級結構
h. 附加序列（RT site, Promoter sequence）加到5'端, 在算Tm值時不算,但在檢測互補和二級結構是要加上它們
i. 使用兼并引物時, 要參考密碼子使用表,注意生物的偏好性,不要在3'端使用兼并引物,并使用 較高的引物濃度（1uM-3uM）
j. 學會使用一種design software. PP5,Oligo6,DNAstar, Vector NTI, Online　desgin et al.
* 引物的另一個重要參數是熔解溫度（Tm）。這是當50％的引物和互補序列表現為雙鏈DNA分子時的溫度.Tm對于設定PCR退火溫度是必需的。在理想狀態下，退火溫度足夠低，以保證引物同目的序列有效退火， 同時還要足夠高，以減少非特異性結合。合理的退火溫度從55℃到70℃。退火溫度一般設定比引物的 Tm低5℃。
  設定Tm有幾種公式。有的是來源于高鹽溶液中的雜交，適用于小于18堿基的引物。
  有的是根據GC含量估算Tm。確定引物Tmzui可信的方法是近鄰分析法。這種方法從序列一級結構和 相鄰堿基的特性預測引物的雜交穩定性。大部分計算機程序使用近鄰分析法。
根據所使用的公式及引物序列的不同，Tm會差異很大。因為大部分公式提供一個估算的Tm值，所有退火溫度只是一個起始點。可以通過分析幾個逐步提高退火溫度的反應以提高特異性。開始低于估算的Tm5℃，以2℃為增量，逐步提高退火溫度。較高的退火溫度會減少引物二聚體和非特異性產物的形成。
  為獲得*結果，兩個引物應具有近似的Tm值。引物對的Tm差異如果超過5℃，就會引物在循環中使用較低的退火溫度而表現出明顯的錯誤起始。如果兩個引物Tm不同，將退火溫度設定為比zui低的Tm低5℃
或者為了提高特異性，可以在根據較高Tm設計的退火溫度*行5個循環，然后在根據較低Tm設計的退火溫度進行剩余的循環。這使得在較為嚴緊的條件下可以獲得目的模板的部分拷貝。

2. stability of primers
定制引物的標準純度對于大多數PCR應用是足夠的。
引物產量受合成化學的效率及純化方法的影響。定制引物以干粉形式運輸。在TE重溶引物，使其zui終濃度為100μM。TE比去離子水好，因為水的pH經常偏酸，會引起寡核苷的水解。 引物的穩定性依賴于儲存條件。應將干粉和溶解的引物儲存在-20℃。以大于10μM濃度溶于TE的引物在 -20℃可以穩定保存6個月，但在室溫（15℃到30℃）僅能保存不到1周。干粉引物可以在-20℃保存至少1年，在室溫（15℃到30℃）zui多可以保存2個月。