PCR實驗操作時的注意事項和要點

實時熒光定量PCR實驗檢測微量感染因子時，容易因為污染的而導致各種問題，因此，進行PCR操作時，操作人員應該嚴格遵守一些操作規程，zui大程度地降低可能出現的PCR污染或杜絕污染的出現。
（1）劃分操作區：目前，普通PCR尚不能做到單人單管，實現*閉管操作，但無論是否能夠達到單人單管，均要求實驗操作在三個不同的區域內進行，PCR的前處理和后處理要在不同的隔離區內進行：
① 標本處理區，包括擴增摸板的制備；

② PCR擴增區，包括反應液的配制和PCR擴增；

③ 產物分析區，凝膠電泳分析，產物拍照及重組克隆的制備。
各工作區要有一定的隔離，操作器材，要有一定的方向性。如：標本制備→PCR擴增→產物分析→產物處理。
切記：產物分析區的產物及器材不要拿到其他兩個工作區。
（2）分裝試劑：PCR擴增所需要的試劑均應在裝有紫外燈的超凈工作臺或負壓工作臺配制和分裝。所有的加樣器和吸頭需固定放于其中，不能用來吸取擴增后的DNA和其他來源的DNA：
① PCR用水應為高壓的雙蒸水；
② 引物和dNTP用高壓的雙蒸水在無PCR擴增產物區配制；
③ 引物和dNTP應分裝儲存，分裝時應標明時間，以備發生污染時查找原因。
(3) 實驗操作注意事項 盡管擴增序列的殘留污染大部分是假陽性反應的原因，樣品間的交叉污染也是原因之一。因此，不僅要在進行擴增反應是謹慎認真，在樣品的收集、抽提和擴增的所有環節都應該注意：
① 戴一次性手套，若不小心濺上反應液，立即更換手套；

② 使用一次性吸頭，嚴禁與PCR產物分析室的吸頭混用，吸頭不要長時間暴露于空氣中，避免氣溶膠的污染；

③ 避免反應液飛濺，打開反應管時為避免此種情況，開蓋前稍離心收集液體于管底。若不小心濺到手套或桌面上，應立刻更換手套并用稀酸擦拭桌面；

④ 操作多份樣品時，制備反應混合液，先將dNTP、緩沖液、引物和酶混合好，然后分裝，這樣即可以減少操作，避免污染，又可以增加反應的度；

⑤ zui后加入反應模板，加入后蓋緊反應管；

⑥ 操作時設立陰陽性對照和空白對照，即可驗證PCR反應的可靠性，又可以協助判斷擴增系統的可信性；

⑦ 盡可能用可替換或可高壓處理的加樣器，由于加樣器zui容易受產物氣溶膠或標本DNA的污染，使用可替換或高壓處理的加樣器。如沒有這種特殊的加樣器，至少PCR操作過程中加樣器應該，不能交叉使用，尤其是PCR產物分析所用加樣器不能拿到其它兩個區；

⑧ 重復實驗，驗證結果，慎下結論。