WB實驗中轉膜步驟的探討

免疫印跡(immunoblotting)又稱蛋白質印跡(western blot)，它是根據抗原抗體的特異性結合檢測復雜樣品中的某種蛋白的方法。western blot是在凝膠電泳和固相免疫測定技術基礎上發展起來的一種新的免疫生化技術。由于免疫印跡(western blot)具有SDS-PAGE的高分辨力和固相免疫測定的高特異性和敏感性，現已成為蛋白分析的一種常規技術。免疫印跡(western blot)常用于鑒定某種蛋白，并能對蛋白進行定性和半定量分析。

主要實驗步驟如下：

1. 蛋白質抽提

實驗對象為組織樣品，取適量(250~500mg)新鮮組織樣品或正確保存的組織樣品，加1ml含蛋白酶抑制劑的總蛋白抽提試劑(或核蛋白抽提試劑)，勻漿后抽提總蛋白(或核蛋白)。

實驗對象為細胞樣品，每份樣品取1×106~1×107細胞，PBS清洗細胞，去PBS加0.1ml~1ml含蛋白酶抑制劑的總蛋白抽提試劑(或核蛋白抽提試劑)抽提總蛋白(或核蛋白)。

2. 蛋白質定量：按BCA蛋白質定量試劑盒操作說明操作，測定樣品濃度。

3. 變性聚丙烯酰胺不連續凝膠電泳(SDS-PAGE)：將準備好的樣品液和預染蛋白marker分別上樣，標準加進*個孔中，電泳分離蛋白。

4. 蛋白質轉移到PVDF膜，按Bio-Rad蛋白轉移裝置說明組裝濾紙凝膠纖維素夾層，30mA恒流條件下，4°C轉移過夜。

5. western blot膜的封閉和抗體孵育

膜在5%脫脂奶粉溶液中室溫孵育1小時以封閉膜上的非特異結合。

封閉過的膜加入一抗室溫孵育1.5小時，抗原抗體結合。

加入HRP標記的二抗體以結合一抗，室溫孵育膜1小時。加入HRP標記的GAPDH抗 體可同時檢測GAPDH含量。

6. western blot結果檢測：化學發光法檢測，膜與化學發光底物孵育，經X膠片曝光顯 影。圖片掃描保存為電腦文件，并用GIS1000分析軟件將圖片上每個特異條帶灰度值的數字化。

7. western blot數據分析：目的蛋白的灰度值除以內參GAPDH/Actin的灰度值以校正誤差，所得結果代表某樣品的目的蛋白相對含量。

8. 提供實驗報告，包括詳細的實驗方法及免疫印跡實驗結果的相關數據。