聚合酶鏈反應

聚合酶鏈反應

PCR-SSCP分析的基本程序為：首先PCR擴增特定靶序列，然后將擴增產物變性為單鏈，進行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳。在不含變性劑的中性聚丙烯酰胺凝膠中電泳時，DNA單鏈的遷移率除與DNA鏈的長短有關外，更主要的是取決于DNA單鏈所形成的構象。在非變性條件下，DNA單鏈可自身折疊形成具有一定空間結構的構象。這種構象由DNA單鏈堿基決定，其穩定性靠分子內局部順序的相互作用（主要為氫鍵）來維持。相同長度的DNA單鏈其順序不同，甚至單個堿基不同，所形成的構象不同，電泳遷移率也不同。PCR產物變性后，單鏈產物經中性聚丙烯酰胺凝膠電泳，靶DNA中含單堿基置換，或數個堿基插入或缺失等改變時，因遷移率變化會出現泳動變位，從而可將變異DNA與正常DNA區分開。由此可見，PCR-SSCP分析技術是一種DNA單鏈凝膠電泳技術，它根據形成不同構象的等長DNA單鏈在中性聚丙烯酰胺凝膠中的電泳遷移率變化來檢測基因變異。該技術已被廣泛用于癌基因和抗癌基因變異的檢測、遺傳病的致病基因分析以及基因診斷、基因制圖等領域。為了高靈敏特異性地顯示SSCP分析結果，現已發展多種PCR-SSCP技術，各有其優勢及適用領域。例如，可以在PCR擴增中用同位素或熒光素等標記引物或核苷，也可以在電泳后用銀染或溴化乙錠染色以顯示結果。這里將重點介紹的放射性同位素PCR-SSCP法。在進行PCR擴增特定靶基因序列時，利用γ-32P-ATP標記引物或直接在PCR反應體系中加入α-32P-dCTP進行PCR擴增，使擴增產物帶有同位素標記物，然后將擴增產物變性為單鏈進行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，放射自顯影顯示結果。利用引物標記或堿基摻入法使PCR擴增產物帶有同位素標記物，均可使產物信號增強幾個數量級。二者相比較，前者經濟、擴增特異性強，多用于大樣本的檢測和篩選；后者操作簡便，適于一般實驗室開展，可用于小樣本或大樣本的檢測和篩查。本節僅介紹同位素標記堿基摻入法。一、試劑準備⒈ PCR相關試劑⒉ α-32P-dCTP⒊ 30％聚丙烯酰胺（29：1）：丙烯酰胺29g、甲叉雙丙烯酰胺 1g，溶于100ml ddH2O中，4 OC保存。⒋ 10％過胺配制方法：1g 過胺，溶于10ml ddH2O中，4 OC保存（可用數周）。⒌ TEMED（N，N，N，N’，N’-四甲基乙二胺）⒍ 5×TBE緩沖液：Tris堿54g、硼酸27.5g、0.5M EDTA(pH 8.0) 20ml，加ddH2O至1000ml。7．變性上樣液：95% 甲酰胺、0.03%二青、0.05%溴酚藍、 20mM EDTA(pH 8.0)二、操作步驟⒈ PCR擴增反應總體積為10μl，在0.5ml微量離心管中加入下列反應成分：10×buffer 1μldNTPmix 70μMDNA模板 100ng引物及Taq DNA酶 依實驗設計要求按比例加入α-32P-dCTP 0.1μl加ddH2O至 10μl