河南省預防型疫苗工程技術研究中心，河南省生物醫藥產業研究院與河南省生物醫藥工程技術研究中心等多個團隊通力合作，在生物制品學雜志發表關于生物反應器大規模培養狂犬病病毒的成果，該研究為150 L生物反應器高密度微載體工藝放大提供了技術支持，為后期開發更大規模高密度微載體反應器工藝奠定基礎。
狂犬病病毒(rabies virus, RABV)是致死率高的病毒，分布于多種哺乳動物宿主，這些宿主與人類之間存在復雜的關系。目前，RABV引起的狂犬病每年造成約5.9萬人死亡。迄今為止，狂犬病發病后幾乎無治、愈病例，主要通過提前接種疫苗來進行預防。我國每年人用狂犬病疫苗的消耗量約1600萬人份。對于狂犬病疫苗的制備，RABV大規模擴增是關鍵技術，也是決定成本的重要因素之一。目前主要采用生物反應器(借助微載體)培養Vero細胞，擴增RABV，再純化病毒等步驟制備狂犬病疫苗，具有成本較低、技術較易控制等優點，本研究在30 L生物反應器的基礎上，嘗試采用150 L生物反應器、高密度微載體培養Vero細胞，擴增RABV，以期為規模化培養RABV，制備狂犬病疫苗提供參考。
應用30 L和150 L生物反應器，以灌流方式培養Vero細胞和CTN-1V株RABV, Cytodex-1微載體濃度20 g/L，培養溫度36～38℃，DO 20%～60%，pH 7.0～7.4，連續13 d收獲病毒液，培養過程中取樣檢測細胞密度、病毒滴度，并對病毒收獲液進行無菌和支原體檢查及抗原、宿主細胞蛋白(host cell protein, HCP)、牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)、DNA殘留量檢測。結果30 L和150 L生物反應器的細胞培養密度均可達1.2×107個/mL以上，在培養過程中各時間點的細胞密度差異均無統計學意義(t=0.225～2.173, P=0.096～0.833)。2種規模生物反應器病毒收獲液均在感染后6 d達高病毒滴度(8.5 lgLD50/mL)，且差異無統計學意義(t=1.000, P=0.374)。2種規模生物反應器病毒收獲液的抗原、HCP、BSA和DNA殘留量基本一致。可用150 L生物反應器大規模培養RABV，病毒收獲液符合《中國藥典》三部(2020版)相關標準。
搖瓶工藝
搖瓶中細胞培養至第4天時，呈致密單層，接種RABV毒種。
生物反應器工藝
細胞培養過程中2種規模生物反應器的細胞密度變化趨勢相似。細胞培養至第4天，密度達12.0×106個/m L以上，30 L生物反應器的細胞密度(12.3×106個/m L)高于150 L生物反應器(12.1×106個/m L)，但二者差異無統計學意義(t=1.138, P=0.319)。接毒后細胞持續生長一段時間，2種規模生物反應器細胞密度均在第6天達最、高，分別為13.3×106和13.0×106個/m L。隨著病毒培養時間的延長，細胞密度呈下降趨勢。2種規模生物反應器在培養過程中各時間點的細胞密度差異均無統計學意義(t=0.225～2.173, P=0.096～0.833)。細胞密度變化曲線見圖1；接種細胞后，細胞貼附在微載體表面，形態飽滿，無游離細胞，第4天呈致密單層，見圖2；接種病毒后，細胞逐漸發生病變，從微載體上脫落，死亡，第13天大部分細胞已脫落，見圖3。
圖1
圖2
圖3
病毒收獲液檢定病毒滴度變化
30和150 L生物反應器中細胞感染2 d后收獲的第1組病毒液滴度平均值分別為(7.60±0.14)和(7.63±0.09)lg LD50/m L；感染4 d后，2種規模生物反應器的細胞密度均下降、收獲液病毒滴度均增加，均在感染后6 d達高病毒滴度，且差異無統計學意義(t=1.000, P=0.374)。隨后病毒滴度緩慢下降，培養結束時，2種規模生物反應器的收獲液病毒滴度均為(7.53±0.12)lg LD50/m L。見表1和圖4。表明從30 L放大至150 L的工藝可獲得高滴度的病毒收獲液。
表1
圖4
結果
搖瓶培養目前主要作為細胞培養擴增步驟，直接應用于規模化生產越來越少。單個搖瓶產能較小，規模化生產需至少數十個搖瓶同步進行，導致人工操作復雜且強度大，存在一定的暴露操作風險。搖瓶培養技術不再是規模化生產的發展方向。
應用生物反應器培養Vero細胞是疫苗制備的關鍵技術，是重要的發展方向之一。且生物反應器易操控，適合規模化放大，應用反應器微載體懸浮培養Vero細胞具有明顯優勢。生物反應器培養可獲得更高的收益率，生物反應器的控制系統可以完成更多工作，可監測和控制的參數數量基于生物反應器中的傳感器和控制元件數量，可以更好的進行培養工藝條件的篩選，優化。工藝簡單、操作靈活，有良好的適用性；培養工藝容易放大，可為生物體生長和增殖提供均質的環境；產品質量穩定，非常適合工業化生產；管路布置較為簡單，能提供較好的無菌條件，細胞生長過程中不易污染。該研究在30 L生物反應器規模實驗的基礎上，實現了在150 L生物反應器進行微載體濃度20 g/L的Vero細胞培養，并接種RABV，細胞病變過程正常且可控，病毒收獲液滴度可高達8.5 lg LD50/m L, 30和150 L生物反應器培養的終末代細胞各項檢測均符合《中國藥典》三部(2020版)要求，為后期開發更大規模高密度微載體生物反應器工藝奠定基礎。
