永生化紅細(xì)胞(RBC)前體的單克隆篩選

人造血液嘗試始于七十多年前，1900年，奧地利醫(yī)學(xué)家卡爾·蘭德斯坦納發(fā)現(xiàn)了ABO血型，讓輸血救人成為了可能。目前，接受手術(shù)、癌癥治療和創(chuàng)傷治療的患者所需的血液供應(yīng)依賴于志愿獻(xiàn)血者。由于需求量大，研發(fā)人造血液以替代人自身血液的想法便產(chǎn)生了。到了20世紀(jì)中后期，由于獻(xiàn)血和輸血造成一些傳染病如艾滋病、乙肝、丙肝等的傳播和流行，也讓人對(duì)輸血用血產(chǎn)生恐懼，因此人們正在努力開(kāi)發(fā)一種更安全、更容易獲得的血液供應(yīng)來(lái)源。

這一挑戰(zhàn)通過(guò)可能的血液嫁接來(lái)解決，利用胚胎細(xì)胞、骨髓細(xì)胞或誘導(dǎo)干細(xì)胞在體外產(chǎn)生血細(xì)胞。通過(guò)癌基因能夠增加細(xì)胞增殖和減少細(xì)胞死亡的能力，來(lái)促進(jìn)通常難以連續(xù)培養(yǎng)的紅系祖細(xì)胞系的細(xì)胞生長(zhǎng)，往往在培養(yǎng)中細(xì)胞系有強(qiáng)勁的增長(zhǎng)，但細(xì)胞群表現(xiàn)出多異質(zhì)表型。由于Cytena克隆篩選單細(xì)胞打印系統(tǒng)（single-cell printer™，scp™）能夠高通量生成單細(xì)胞克隆，以識(shí)別具有理想紅系標(biāo)記表達(dá)的克隆。利用這一工作流程，獲得200多個(gè)單克隆可用于進(jìn)一步的表達(dá)標(biāo)記分析。

本研究為了實(shí)現(xiàn)分化的去核血細(xì)胞的持續(xù)供應(yīng)，開(kāi)發(fā)了從轉(zhuǎn)染到單細(xì)胞克隆的工作流程，以選擇克隆進(jìn)一步分化為成熟的紅細(xì)胞(圖1)。首先，將5種不同的癌基因(c-myc, BCL-XL, SV40, geT, Bmi-1, LhX-2)單獨(dú)或成對(duì)地轉(zhuǎn)染到來(lái)自CD34+干細(xì)胞的紅系祖細(xì)胞系中。

圖1 紅系細(xì)胞克隆生成流程

注：轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，通過(guò)向培養(yǎng)物中添加dox激活癌基因表達(dá)，從而實(shí)現(xiàn)持續(xù)培養(yǎng)。使用single-cell printer™進(jìn)行單細(xì)胞克隆的篩選，挑出具有表面標(biāo)記的特異性單克隆，在通過(guò)添加干細(xì)胞因子(SCF)和促紅細(xì)胞生成素(EPO)進(jìn)一步分化，進(jìn)一步分化為紅系細(xì)胞。

轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，通過(guò)添加強(qiáng)力     丨霉素(dox)激活癌基因表達(dá)。發(fā)現(xiàn)個(gè)體癌基因轉(zhuǎn)導(dǎo)不會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞永生化，只有聯(lián)合轉(zhuǎn)導(dǎo)c-myc和BCL-XL才能使紅系前體細(xì)胞永生化，細(xì)胞可以在培養(yǎng)中保存并增殖一年以上(圖2A)，除了長(zhǎng)期培養(yǎng)的能力外，永生化細(xì)胞還表現(xiàn)出早期造血祖細(xì)胞的典型標(biāo)志物，包括CD34^{very low}CD45^+/-CD133^+/-CD71⁺CD44^highCD105^highCD235a^{very low}。然而，去除dox致癌基因表達(dá)失活，使進(jìn)一步分化成為可能(圖2B)。

注：圖2（A）永生化紅系祖細(xì)胞的增殖率。（B）去除dox降低了三種不同細(xì)胞克隆的c-myc和BCL-XL癌基因的mRNA表達(dá)(編號(hào)8,29和34)。

與傳統(tǒng)方法相比，

single-cell printer™提供了一種高通量分離單細(xì)胞克隆的方法，用于進(jìn)一步的下游分析和篩選。此技術(shù)基于類似噴墨的原理，將細(xì)胞樣品加入至包含微流體結(jié)構(gòu)的芯片中，芯片的底部有一個(gè)噴嘴，自由飛行的小液滴在那里被分配，對(duì)噴嘴進(jìn)行連續(xù)成像，以確定產(chǎn)生的液滴中是否含有0、1或多個(gè)細(xì)胞，如果一個(gè)液滴含有一個(gè)細(xì)胞，它將被分配到目標(biāo)孔板，如果液滴不包含細(xì)胞/多個(gè)細(xì)胞，液滴將作為廢物處理。

紅系祖細(xì)胞被分配到5個(gè)充滿半固體培養(yǎng)基的96孔板（兼容384孔板）。連續(xù)的五張圖像(圖3A)作為單克隆源性的保證，并確保只分配了一個(gè)細(xì)胞。經(jīng)統(tǒng)計(jì)有97.7%的孔(469/480)分配到單個(gè)細(xì)胞，其中超過(guò)200個(gè)可以形成單克隆，在進(jìn)一步分析形態(tài)和表面標(biāo)記物中發(fā)現(xiàn)表達(dá)較理想(CD71、CD45、CD34、CD235a)。從培養(yǎng)物中去除Dox，在7天內(nèi)進(jìn)一步分化為產(chǎn)生血紅蛋白的細(xì)胞(圖3B)，突出了可能發(fā)育為成熟紅細(xì)胞的潛力。

注：圖3（A）single-cell printer™記錄沉積到目標(biāo)板中的單個(gè)細(xì)胞來(lái)源的克隆性保證，單細(xì)胞沉積效率為97.7%。（B）紅系祖細(xì)胞克隆(29)進(jìn)行進(jìn)一步分化，去除dox，加入SCF和EPO。通過(guò)染色顯示，培養(yǎng)物中存在產(chǎn)生血紅蛋白的細(xì)胞。

本研究表明，通過(guò)轉(zhuǎn)染c-myc和BCL-XL癌基因，典型的非分裂前體RBC前體可以獲得永生化。所得到的細(xì)胞系是異質(zhì)的，需要單細(xì)胞克隆來(lái)篩選理想的細(xì)胞特征。與傳統(tǒng)方法相比，single-cell printer™在保持細(xì)胞活力的同時(shí)，實(shí)現(xiàn)了高通量、穩(wěn)健的單細(xì)胞克隆開(kāi)發(fā)方法，能夠產(chǎn)生超過(guò)200個(gè)克隆，這些克隆后來(lái)被進(jìn)一步分化并鑒定為具有關(guān)鍵的祖細(xì)胞標(biāo)記物。

參考文獻(xiàn)

single-cell printer™ | Generating single-cell clones of immortalized red blood cell (RBC) precursors using single-cell dispensing. Romy Kronstein Widemann¹, Stefan Zimmermann², Torsten Tonn¹.

關(guān)于Cytena公司

Cytena公司潛心研究單細(xì)胞打印機(jī)（single-cell printer™）技術(shù)多年，不斷升級(jí)設(shè)備功能，以一貫溫和的分選原理、更加快速的分選效率、更加簡(jiǎn)易的操作步驟，助力抗體、細(xì)胞治療、基因治療、干細(xì)胞等研究領(lǐng)域的客戶快速搭建單細(xì)胞篩選平臺(tái)。艾貝泰生物科技有限公司作為Cytena的單細(xì)胞打印機(jī)總代理商，為您提供優(yōu)質(zhì)的售前售后服務(wù)。