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閱讀：145發布時間：2024-7-13
海水浮游植物色素測定
萃取熒光法(葉綠素a)
方法原理
葉綠素a的丙酮萃取液受藍光激發產生紅色熒光,過濾一定體積海水所得的浮游植物用90%丙酮提取其色素,使用熒光計測定提取液酸化前后的熒光值,計算出海水中葉綠素a的濃度。
主要儀器設備
a)熒光計 :激發光波長450 nm,發射光波長685 nm;
b) 抽濾裝置:包括濾器、支架、抽濾瓶和真空泵;
c)玻璃纖維濾膜:其截留效率相當于0.65μm孔徑的聚碳酸酯微孔濾膜;
d) 冰箱。
試劑
體積分數為90%的丙酮、體積分數為10%的鹽酸、碳酸鎂溶液p(MgCO:)=10g/dm2。
測定步驟
熒光計校準校準頻率
至少每半年一次。
標準葉綠素 a溶液(ρ=1 mg/dm3 )制備
過濾一定量的生長良好、處于指數生長前期的培養硅藻,用90%丙酮提取其葉綠素a,或者用90%丙酮溶解一定量的市售葉綠素a結晶,濃度大約為p=1 mg/dm'。
標準葉綠素a溶液濃度標定
使用分光光度計正確測定標準葉綠素a溶液的濃度。.
葉綠素a標準工作溶液配制
用上述標準葉綠素a溶液配制濃度不同的標準工作溶液,供各量程檔校準用。
換算系數 Fs的測定
上述不同濃度的標準工作溶液,在不同量程檔上進行酸化前后熒光值的測定。各量程檔的換算系
采樣過濾 .
采樣后,應盡快過濾。過濾海水的體積視調查海區而定,富營養海區一般可過濾50 ~100 cm3 ;
中營養海區過濾200 cm°~500 cm3 ;寡營養海區可過濾500 cm°~1 000 cm"。過濾時抽氣負壓應小于50 kPa,。
濾膜保存
過濾后的濾膜應在1h內提取,若無條件提取測量,可將濾膜對折,用鋁箔包好,存放于低溫冰箱(-20C),保存期可為60 d或放人液氮中保存期可為一年。
提取
將載有浮游植物的濾膜放人加有10 cm8體積分數為90%丙酮的提取瓶內,蓋緊,搖蕩,立即放于低溫(0C)冰箱內,提取12 h~24 h。
熒光測定.
測定步驟如下:
a) 取出樣品放在室溫、黑暗處約0.5 h,使樣品溫度與室溫一致;
b)每批樣品測定前后,以體積分數為90%丙酮作對比液,測出各量程檔的空白熒光值Fo和Fo2;
c)將提取瓶內，上清液倒人測定池中,選擇適當量程檔,測定樣品的熒光值R;
d) 加1滴體積分數為10%鹽酸于測定池中,30 s后測定其熒光值R。;
e) 將結果記錄于表。
分光光度法(包括葉綠素a.b和c)
方法原理
葉綠素a、b、c的丙酮萃取液在紅光波段各有一吸收峰。一定體積海水中的浮游植物經濾膜濾出,用90%丙酮提取其葉綠素,應用分光光度計測定,根據三色分光光度法方程,計算海水中葉綠素a、b.c的濃度。
試劑
碳酸鎂溶液:p( MgCO3)= 10 mg/dm' ;體積分數為90%的丙酮。
主要儀器設備
主要儀器設備有以下幾種:
a)分光光度計:波長必須準確,波帶寬度≤2nm,消光值可讀到0.001;
b)抽濾裝置:見5.2.1.2 b);
c)濾膜:截留 效率相當于0.65 μm孔徑的聚碳酸酯核孔濾膜或玻璃纖維濾膜、纖維素酯微孔濾膜或其他濾膜;
d)貯樣干燥器、研磨器、離心機.具塞離心管和冰箱。
測定步驟
采樣過濾
采樣后應盡快過濾。將濾膜置于濾器上,加5cm°碳酸鎂溶液,接著過濾海水樣,過濾時負壓應小于50kPa。過濾海水體積視調查水域而定,近岸水取0.5dm'~2dm3,外海水取5dm*~10dm'。
保存
過濾后的樣品應立即研磨提取。若條件不允許,可將濾膜對折兩次,置于貯樣干燥器內低溫(<- 20C )黑暗保存,期限最長兩個月。
研磨
將載有浮游植物的濾膜放人研磨器,加2cm2或3cm3體積分數為90%的丙酮，研磨,后將樣品移入具塞離心管中,研磨器用體積分數為90%丙酮洗滌2次或3次,洗滌液一并倒人離心管中,但總體積不
能超過10 cm23
提取
將具塞離心管置于低溫黑暗處提取30min。
離心
提取液于4000 r/min 條件下離心10 min,上清液倒人刻度試管中,并定容為10 cm°或15 cm"。
測定
將提取液注人光程為1 cm~10 cm的比色槽中，以體積分數為90%丙酮作空白對照,用分光光度計測定波長為750 nm、664 nm、647 nm、630 nm處的溶液消光值。測定結果記錄于表。
消光值選擇
作濁度校正的750 nm處消光值不超過每厘米光程0. 005,664 nm處消光值在0. 1~0.8之間。
高效液相色譜(HPLC)法
方法原理
浮游植物所含各種光合色素經提取后,在一定溶劑系統中,可經高效液相色譜柱進行分離,再由檢測器檢測并獲得色譜圖。根據與標準色素比較保留時間及色譜圖可鑒別色素種類,根據色譜峰的面積可計算含量。
主要儀器設備
a) 高效液相色譜儀:包括溶劑流動相系統、高壓泵、進樣器、色譜柱、檢測器、計算機等;
b)抽濾裝置、玻璃纖維濾膜、液氮罐、超聲波粉碎器和離心機等。
試劑
丙酮、水、甲醇.乙腈和乙酸乙酯(均為色譜純);醋酸銨;BHT(2,6-二叔丁基對甲酚)、角黃素。
測定步驟
采樣過濾
采樣后,應盡快過濾,視海水中浮游植物數量,過濾0.5 dm°~4 dm’海水(貧營養海區3 dm3 ~4 dm3 ,中等營養海區1 dm*~2 dm2 ,富營養海區0.5 dm°~1 dm' ),過濾時使用孔徑為0.65 μm、直徑為25mm的玻璃纖維濾膜，抽濾負壓不超過50kPa,并注意避光。
保存
過濾后,如不能立即提取，濾膜應保存在液氮罐中。在放入液氮或超低溫冷凍之前,冷凍保存(-20C)不能超過20h。濾膜可用預先標記好的鋁箔包裹保存。
萃取
將濾膜從液氮中取出,解凍約1min,放人玻璃離心管中,加入3cm290%丙酮,再加入50mm'角黃素作內標準物(角黃素亦可預先加在提取溶劑丙酮中)。用體積分數為90%丙酮提取一張玻璃纖維濾膜作空白樣。混合物用超聲波粉碎(50 W, 30s),然后在0C條件下提取24 h。分析前將提取物混勻后離心去除細胞殘屑,并用載有聚四氯乙烯濾膜(直徑13mm,孔徑0.2μm)的注射式濾器過濾。
高效液相色譜測定
HPLC系統準備
a)高壓進樣閥(帶有 200 mm'樣品環);
b) C-18保護柱(50 mmX4.6 mm);
c) 反相C-18色譜分析柱(250 mmX4.6 mm);
d) 紫外-可見吸收檢測器(測定波長為436 nm和450 nm);
e)配有數據處理系統軟件的計算機;
f) HPLC溶劑:
溶劑A:甲醇: 0.5 mol醋酸銨(80 : 20)，0.01%BHT;
溶劑B:乙腈:水(87.5: 12.5), 0.01%BHT;
溶劑C:乙酸乙酯。
以上溶劑均用色譜純,使用前以0.45pum濾膜過濾。
操作步驟
a) 用溶劑A建立并平衡HPLC系統1 h,流量為1 cm2 /min;
b)根據所測樣 品的濃度范圍,每種色素準備至少5個濃度的工作標準液，并以該標準液校正
HPLC系統;
c)取每種工作標準液1000mm3,以300mm3蒸餾水稀釋,混勻并平衡5min,潤洗樣品注射器兩次,進樣500mm2(樣品環體積的2.5倍);
d)色素樣品和空白樣的準備及進樣方法同標準液。注意進樣時應避免有氣泡,樣品間的進樣間隔應保持均勻。預先混有蒸餾水或其他溶劑的樣品不能滯留在自動進樣器中,以免疏水性的色素從溶液中析出;
e) 進樣后通過梯度洗脫程序(見表2)對葉綠素和類胡蘿卜素進行分離,分析過程中通過氦氣或在線脫氣機對流動相溶液進行脫氣;
f)根據比較色素樣品與標準的色譜峰的保留時間來鑒定樣品的色素種類,收集各洗脫峰可進一步進行分光確定;
g) 填寫表。
以上三種方法以萃取熒光法優先
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