蛋白質(zhì)和吊白塊的檢測(cè)方法與操作步驟！
蛋白質(zhì)和吊白塊的檢測(cè)方法與操作步驟！
一、蛋白質(zhì)的檢測(cè)
1 凱氏定氮法
2 規(guī)范性引用性文件
本標(biāo)準(zhǔn)中引用的文件對(duì)于本標(biāo)準(zhǔn)的應(yīng)用是的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本標(biāo)準(zhǔn)。凡是不注日期的引用文件，其版本(包括所有的修)適用于本標(biāo)準(zhǔn)。
3 原理
食品中的蛋白質(zhì)在催化加熱條件下被分解，產(chǎn)生的氨與硫酸結(jié)合生成硫酸銨。堿化蒸餾使氨游離，用硼酸吸收后以硫酸或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液滴定，根據(jù)酸的消耗量乘以換算系數(shù)，即為蛋白質(zhì)的含量。
4 試劑和材料
除非另有規(guī)定，本方法中所用試劑均為分析純，水為 GB/T 6682 規(guī)定的三級(jí)水。
4.1 硫酸銅(CuSO4·5H2O)
4.2 硫酸鉀(K2SO4)
4.3 硫酸(H2SO4 密度為 1.84g/L)
4.4 硼酸(H3BO3)
4.5 甲基紅指示劑(C15H15N3O2)
4.6 溴甲酚綠指示劑(C21H14Br4O5S)
4.7 亞甲基藍(lán)指示劑(C16H18ClN3S·3H2O)
4.8 氫氧化鈉(NaOH)
4.9 95%乙醇(C2H5OH)
4.10 硼酸溶液(20 g/L)：稱取 20 g 硼酸，加水溶解后并稀釋至 1000 mL。
4.11 氫氧化鈉溶液(400 g/L)：稱取 40 g 氫氧化鈉加水溶解后，放冷，并稀釋至 100 mL。
4.12 硫酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液(0.0500 mol/L)或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液(0.0500 mol/L)。
4.13 甲基紅乙醇溶液(1 g/L)：稱取 0.1g 甲基紅，溶于 95%乙醇，用 95%乙醇稀釋至 100 mL。
4.14 亞甲基藍(lán)乙醇溶液(1 g/L)：稱取 0.1g 亞甲基藍(lán)，溶于 95%乙醇，用 95%乙醇稀釋至 100 mL。
4.15 溴甲酚綠乙醇溶液(1 g/L)：稱取 0.1g 溴甲酚綠，溶于 95%乙醇，用 95%乙醇稀釋至 100 mL。
4.16 混合指示液：2 份甲基紅乙醇溶液(4.13)與1 份亞甲基藍(lán)乙醇溶液(4.14)臨用時(shí)混合。也可用1 份甲基紅乙醇溶液(4.13)與 5 份溴甲酚綠乙醇溶液(4.15)臨用時(shí)混合。
5 儀器和設(shè)備
5.1 天平：感量為 1mg
5.2 定氮蒸餾裝置：如圖 1所示
5.3 自動(dòng)凱氏定氮儀
6 分析步驟
6.1 凱氏定氮法
6.1.1 試樣處理：稱取充分混勻的固體試樣 0.2 g～2 g、半固體試樣 2 g～5 g或液體試樣 10 g～25 g(約相當(dāng)于 30 mg～40 mg 氮) ，至 0.001 g，移入干燥的 100 mL、250 mL 或 500 mL 定氮瓶中，加入 0.2 g 硫酸銅(4.1) 、6 g 硫酸鉀(4.2)及 20 mL 硫酸(4.3) ，輕搖后于瓶口放一小漏斗，將瓶以 45°角斜支于有小孔的石棉網(wǎng)上。小心加熱，待內(nèi)容物全部炭化，泡沫*停止后，加強(qiáng)火力，并保持瓶?jī)?nèi)液體微沸，至液體呈藍(lán)綠色并澄清透明后，再繼續(xù)加熱 0.5 h～1 h。取下放冷，小心加入 20 mL 水。放冷后，移入 100 mL 容量瓶中，并用少量水洗定氮瓶，洗液并入容量瓶中，再加水至刻度，混勻備用。同時(shí)做試劑空白試驗(yàn)。
6.1.2 測(cè)定：按圖 1 裝好定氮蒸餾裝置，向水蒸氣發(fā)生器內(nèi)裝水至 2/3 處，加入數(shù)粒玻璃珠，加甲基紅乙醇溶液(4.13)數(shù)滴及數(shù)毫升硫酸(4.3) ，以保持水呈酸性，加熱煮沸水蒸氣發(fā)生器內(nèi)的水并保持沸騰。
6.1.3 向接收瓶?jī)?nèi)加入 10.0 mL 硼酸溶液(4.10)及 1 滴～2 滴混合指示液(4.16) ，并使冷凝管的下端插入液面下， 根據(jù)試樣中氮含量， 準(zhǔn)確吸取 2.0 mL～10.0 mL 試樣處理液由小玻杯注入反應(yīng)室， 以 10 mL水洗滌小玻杯并使之流入反應(yīng)室內(nèi)，隨后塞緊棒狀玻塞。將 10.0 mL 氫氧化鈉溶液(4.11)倒入小玻杯，提起玻塞使其緩緩流入反應(yīng)室，立即將玻塞蓋緊，并加水于小玻杯以防漏氣。夾緊螺旋夾，開(kāi)始蒸餾。蒸餾 10 min后移動(dòng)蒸餾液接收瓶，液面離開(kāi)冷凝管下端，再蒸餾 1 min。然后用少量水沖洗冷凝管下端外部， 取下蒸餾液接收瓶。 以硫酸或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液(4.12)滴定至終點(diǎn)， 其中 2 份甲基紅乙醇溶液(4.13)
與 1 份亞甲基藍(lán)乙醇溶液(4.14)指示劑，顏色由紫紅色變成灰色，pH 5.4;1 份甲基紅乙醇溶液(4.13)與 5 份溴甲酚綠乙醇溶液(4.15)指示劑，顏色由酒紅色變成綠色，pH 5.1。同時(shí)作試劑空白。
1-電爐;2-水蒸氣發(fā)生器(2 L 燒瓶) ;3-螺旋夾;4-小玻杯及棒狀玻塞;5-反應(yīng)室;6-反應(yīng)室外層;7-橡皮管及螺旋夾;8-冷凝管;9-蒸餾液接收瓶。
6.2 自動(dòng)凱氏定氮儀法
稱取固體試樣0.2 g～2 g、 半固體試樣2 g～5 g或液體試樣10 g～25 g (約相當(dāng)于30 mg～40 mg氮) ，至 0.001 g。按照儀器說(shuō)明書(shū)的要求進(jìn)行檢測(cè)。
7 分析結(jié)果的表述
試樣中蛋白質(zhì)的含量按式(1)進(jìn)行計(jì)算。
式中：
X——試樣中蛋白質(zhì)的含量，單位為克每百克(g/100 g) ;
V1——試液消耗硫酸或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定液的體積，單位為毫升(mL) ;
V2——試劑空白消耗硫酸或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定液的體積，單位為毫升(mL) ;
V3——吸取消化液的體積，單位為毫升(mL) ;
c——硫酸或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液濃度，單位為摩爾每升(mol/L) ;
0.0140——1.0 mL 硫酸[c (1/2H2SO4)=1.000 mol/L]或鹽酸[c (HCl) =1.000 mol/L]標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液相當(dāng)?shù)牡馁|(zhì)量，單位為克(g) ;
m——試樣的質(zhì)量，單位為克(g) ;
F——氮換算為蛋白質(zhì)的系數(shù)。一般食物為 6.25;純?nèi)榕c純?nèi)橹破窞?6.38;面粉為 5.70;玉米、高梁為 6.24;花生為 5.46;大米為 5.95;大豆及其粗加工制品為 5.71;大豆蛋白制品為 6.25;肉與肉制品為 6.25;大麥、小米、燕麥、裸麥為 5.83;芝麻、向日葵為 5.30;復(fù)合配方食品為 6.25。 以重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的算術(shù)平均值表示，蛋白質(zhì)含量≥1 g/100 g 時(shí)，結(jié)果保留三位有效數(shù)字;蛋白質(zhì)含量<1 g/100 g 時(shí)，結(jié)果保留兩位有效數(shù)字。
8 精密度
在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的差值不得超過(guò)算術(shù)平均值的 10 %。
二、吊白塊檢測(cè)
目前，食品中吊白塊含量的測(cè)定只是通過(guò)對(duì)食品中甲醛含量的測(cè)定來(lái)判定的，由于天然食品中也有可能存在極少量的甲醛，若測(cè)定結(jié)果發(fā)現(xiàn)食品中甲醛呈陽(yáng)性，并不能就此說(shuō)明食品中含有吊白塊成分，若食品中甲醛含量較高且二氧化硫含量也相應(yīng)較高時(shí)，則基本上可以判定該食品中含有吊白塊成分。通過(guò)對(duì)試劑、吸收波長(zhǎng)、線性、回收率、重現(xiàn)性等相關(guān)試驗(yàn)，制定了一個(gè)比較切實(shí)可行的食品中吊白塊含量的檢測(cè)方法，具體介紹如下：
1、原理
在酸性條件下，對(duì)樣品進(jìn)行蒸餾，餾出物用水吸收，吸收液中的甲醛與乙酰丙酮及銨離子反應(yīng)，生成黃色物質(zhì)，與標(biāo)準(zhǔn)系列比較定量。在另一酸性條件下，對(duì)樣品重新進(jìn)行蒸餾，餾出物用2%乙酸鉛水溶液吸收，吸收液酸化后，用標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定測(cè)定二氧化硫含量。
2、主要儀器與試劑
2.1、分光光度計(jì)
2.2、磷酸(AR級(jí))
2.3、乙酰丙酮溶液：在100ml蒸餾水中加入醋酸銨25 g，冰醋酸3 mL和乙酰丙酮0.4 mL，振搖促溶，儲(chǔ)備于棕色瓶中，此液可保存1個(gè)月。
2.4、甲醛標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：吸取10 mL甲醛(38%～40%)，移入500 mL容量瓶中，加入0.5 mL硫酸(1+35)，加水稀釋至刻度，混勻。吸取5 mL，置于250 mL量瓶中，加0.1 mol/L標(biāo)準(zhǔn)溶液50 mL，1mol/L KOH溶液20 mL，在室溫放置15 min后，加10%硫酸15 mL酸化，再放置15 min后，加入50 mL蒸餾水，用0.1 mol/L*標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至草黃色，加入新配制的0.5%淀粉指示劑1 mL，繼續(xù)滴定至蘭色消失為終點(diǎn)，同時(shí)做空白試驗(yàn)。甲醛標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液濃度計(jì)算：
X=(V1-V2)×C×15/5
2.5、甲醛標(biāo)準(zhǔn)使用液
將標(biāo)定后的甲醛標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用水稀釋至5 μg/mL。
3、操作步驟
3.1、標(biāo)準(zhǔn)曲線制備
分別吸取0，0.50，1.00，3.00，5.00，7.00 mL甲醛標(biāo)準(zhǔn)使用液(相當(dāng)于0，2.5，5.0，15.0，25.0，35.0 μg甲醛)于25 mL比色管中，補(bǔ)充蒸餾水至10 mL，加入1 mL乙酰丙酮溶液(2.3)，混勻，置沸水浴中3 min，取出冷卻，于415 nm波長(zhǎng)處，以零管調(diào)節(jié)零點(diǎn)，用1 cm比色皿進(jìn)行比色，根據(jù)測(cè)得的吸光值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
3.2、樣品處理
稱取經(jīng)粉碎的樣品5～10 g，置于500ml蒸餾瓶中，加入蒸餾水200 mL，磷酸(2.2)15 mL，立即進(jìn)行加熱蒸餾，冷凝管下口應(yīng)事先插入盛有10mL蒸餾水且置于冰浴的容器中。收集蒸餾液約180 mL，定容至200 mL，另作空白蒸餾。
3.3、顯色操作
視所檢試樣中吊白塊含量高低，吸取2～10mL蒸餾液(3.2)，補(bǔ)充蒸餾水至10 mL，加入1 mL乙酰丙酮溶液(2.3)，混勻，置沸水浴中3 min，取出冷卻，于415 nm波長(zhǎng)處，以蒸餾水調(diào)節(jié)零點(diǎn)，用1 cm比色皿進(jìn)行比色，根據(jù)測(cè)得的吸光值，由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算結(jié)果。
4、計(jì)算
X1= (V2×W1×5.133)/(W2×V2×V3 )
式中：X1;試樣中吊白塊的含量，mg/kg;
V1：樣品管相當(dāng)于標(biāo)準(zhǔn)管體積，ml;
W1：每ml甲醛標(biāo)準(zhǔn)液含甲醛量，μg;
W2：試樣重，g‘
V2：顯色操作所取蒸餾液體積，ml;
V3：蒸餾液總體積，ml;
5.133：甲醛換算為吊白塊系數(shù)。
注：若將磷酸改為1+1的鹽酸，蒸餾液用2%乙酸鉛溶液吸收，通過(guò)對(duì)該吸收液二氧化硫的測(cè)定，可作為在甲醛存在下確定是否有吊白塊的依據(jù)。
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