美谷分子酶標儀助力原料酶的工藝優(yōu)化及質控

以當下極為火熱的mRNA賽道為例，mRNA疫苗的研發(fā)與生產(chǎn)需要用到一系列的單酶，包括用于模板轉錄的T7 RNA聚合酶、用于加帽加尾修飾的牛痘病毒加帽酶、2'-O-甲基轉移酶、Poly(A)加尾酶等。這些酶在mRNA疫苗工業(yè)化生產(chǎn)中，對于mRNA的穩(wěn)定表達具有重要影響。在細胞治療中的基因編輯技術, 需要用到Cas9、Cas12a等Cas酶進行CRISPR基因編輯系統(tǒng)的位點切割，這些酶會影響基因編輯的效力和精確性。在干細胞的培養(yǎng)中，采用干細胞活化酶可以促使干細胞的大量生長。

總體而言，酶作為一種高效催化劑，已經(jīng)在生物制藥的多個細分領域發(fā)揮重要作用，并且隨著合成生物學的興起，酶的應用前景將會更加廣闊。

目前，已知能利用酶與微生物進行的轉化反應有60余種，因此，酶工程技術已成為新藥開發(fā)和改造傳統(tǒng)制藥工藝的重要手段。酶工程技術主要是指通過基因工程菌、酶分子修飾、酶定向進化、發(fā)酵等生物、化學技術來產(chǎn)生目的酶或者提升酶的性能、產(chǎn)量等符合實際應用的需求。國內外有諸多學者基于藥物對生物機體的復雜作用，利用酶來研究、設計和開發(fā)藥物，并且這一技術在開發(fā)和設計新藥品時展現(xiàn)出良好的效果?；谥两裼糜谏虡I(yè)規(guī)模生產(chǎn)的工業(yè)酶數(shù)量依然有限，引入人工智能算法和大量分子生物學底層創(chuàng)新工具，以及運用高度自動化設備，正在推動生物酶制造行業(yè)的發(fā)展。

比如對于酶的生產(chǎn)，發(fā)酵法是目前工業(yè)生產(chǎn)的主流方法，其是指在人工控制的條件下，利用微生物培養(yǎng)來獲得人們所需要的酶。發(fā)酵法產(chǎn)酶的主要優(yōu)點是微生物生長繁殖快、生長周期短、產(chǎn)量高且可以進行大規(guī)模培養(yǎng)。因此，篩選優(yōu)良的產(chǎn)酶菌種以及優(yōu)化合適的產(chǎn)酶條件有利于縮短生產(chǎn)周期，提高酶的質量和產(chǎn)量。通常一個優(yōu)良的產(chǎn)酶菌要求繁殖快，產(chǎn)酶量高，能在便宜的底物上生長良好，產(chǎn)酶性能穩(wěn)定，菌株不易退化。對于產(chǎn)酶菌株的篩選，可以采用自然界的產(chǎn)酶菌株，或者通過基因組篩選出特定酶基因進行分子克隆構建酶工程菌，或者通過酶的定向進化即通過對酶基因進行多輪突變和表達并篩選出特定的酶工程菌。這三種方式都需要重復篩選大量的多樣性克隆庫，因為符合要求的克隆都是極其稀少的，因此篩選的整個過程需要花費大量的時間和人力。丹納赫生命科學旗下美谷分子儀器的Qpix 400系列高通量微生物篩選系統(tǒng)，可以自動吸取樣品并均勻涂布到瓊脂平板，通過大小、外形、間距、顏色、熒光、酶水解圈等條件對克隆進行篩選，并自動化挑取克隆到孔板，還可以自動化進行克隆庫的復制、重排等操作，大大提高克隆的篩選速度并節(jié)省時間。

而產(chǎn)酶條件的優(yōu)化通常需要進行培養(yǎng)基的優(yōu)化，如調整培養(yǎng)基中的碳源、氮源、無機鹽等成份的比例和濃度；培養(yǎng)條件調控，包括溫度、pH值、培養(yǎng)時間、初始菌液濃度等的調節(jié)；有時候還需要添加輔助物質如酶誘導劑、共誘導劑等促進酶的合成和分泌。丹納赫生命科學旗下貝克曼庫爾特生命科學的BioLector-XT微型生物反應器可一次進行48個樣品的平行培養(yǎng)，并可在線監(jiān)測生物量、pH值、溶氧（DO）和各種熒光分子或蛋白質的熒光強度，同時還能結合微流控芯片技術實現(xiàn)各培養(yǎng)孔獨立的pH控制和補料分批培養(yǎng)，并可放大工藝，非常適用于DoE環(huán)境下的菌株篩選和小試期間的培養(yǎng)工藝優(yōu)化，繼而為微生物的高質量放大培養(yǎng)提供指導。

例如，對大腸桿菌表達T7聚合酶生產(chǎn)用酵母營養(yǎng)素和誘導時間的篩選，采用了7種酵母營養(yǎng)素和6個誘導時間在Biolector上進行培養(yǎng)以及生物量和產(chǎn)量的在線分析，獲得了產(chǎn)量更高的酵母營養(yǎng)素培養(yǎng)基和更佳的誘導條件。

隨著酶越來越多地用于創(chuàng)新藥物的生產(chǎn)，對酶的質控也提出了更高的要求。從法規(guī)層面來看，酶有按照生物制品來進行質控管理的趨勢。我國2020版藥典第一次收錄了無動物源性重組胰蛋白酶的質量標準，胰蛋白酶在生物制品生產(chǎn)過程中是一種重要的生物原材料。該標準在USP39新增附錄“<89>藥品生產(chǎn)用輔料--酶”部分也被收錄。

丹納赫生命科學旗下SCIEX的毛細管電泳PA 800 Plus制藥分析系統(tǒng)采用激光誘導熒光檢測器以及CE-SDS的電泳模式（CGE-LIF），可對mRNA制備過程中的酶進行純度質控。mRNA合成過程使用的酶的濃度比較低，通常只有0.1-0.5 mg/ml，且鹽濃度較高，需要一種高靈敏度的蛋白純度檢測方法。CGE-LIF搭配P503染料，具有樣品前處理簡便、檢測靈敏度高等特點。