應(yīng)用HaloTag pull-down技術(shù)鑒定了與胡楊CPK21互作的重金屬脅迫相關(guān)蛋白

鎘(Cd)污染因其毒性在全球范圍內(nèi)造成了嚴(yán)重的生態(tài)問題，重金屬對植物造成的傷害除了離子毒害效應(yīng)，還會影響植物的水分狀況，造成植物生理干旱。當(dāng)前，干旱也已成為全球農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)和發(fā)展的重大威脅。

胡楊（Populus euphratica）是廣泛分布于我國西北干旱、鹽堿地區(qū)的一種高大喬木，具有很強(qiáng)的抗旱耐鹽能力，并且能夠吸收和積累重金屬，是研究樹木抗逆生理和分子機(jī)制的重要模式樹種。

鈣(Ca2+)是植物感知生物和非生物脅迫的典型信號分子，Ca2+信號和cpk對廣泛的環(huán)境刺激做出反應(yīng)，并協(xié)調(diào)信號網(wǎng)絡(luò)和生理反應(yīng)(Poovaiah等，2013)。然而，Ca2+信號和cpk是否調(diào)節(jié)植物對重金屬的反應(yīng)很少被研究。

2023年12月19日，北京林業(yè)大學(xué)陳少良教授課題組研究成果，發(fā)表在Plant Stress期刊上（影響因子5.0），文章題目為Populus euphratica CPK21 interacts with heavy metal stress-associated proteins to mediate Cd tolerance in Arabidopsis。

該研究借助HaloTag pull-down技術(shù)，富集了PeCPK21相互作用蛋白，Cd處理后相應(yīng)的表達(dá)譜表明，PeCPK21與重金屬脅迫相關(guān)蛋白(HMAPs)相互作用，介導(dǎo)了轉(zhuǎn)基因擬南芥對Cd的耐受性。

1.Cd處理的胡楊中的PeCPK21表達(dá)

PeCPK21的表達(dá)在根和葉中不同。葉片中，PeCPK21轉(zhuǎn)錄物在CdCl2處理3小時(shí)后增加，6小時(shí)達(dá)到峰值，隨后迅速下降，12h后進(jìn)一步增加。根系中，Cd處理12 h后PeCPK21顯著增加，24h達(dá)到峰值，而后迅速下降。

2.Cd激活擬南芥PeCPK21啟動子表達(dá)

胡楊PeCPK21啟動子構(gòu)建PeCPK21pro轉(zhuǎn)到擬南芥中。無CdCl2脅迫，根、子葉和下胚軸中GUS信號濃度較低。CdCl2脅迫，根，子葉和下胚軸中的GUS活性增加。結(jié)果表明Cd激活PeCPK21，PeCPK21在胡楊根葉表達(dá)增加。

3.PeCPK21轉(zhuǎn)基因擬南芥的Cd耐受性

作者選擇8個(gè)PeCPK21轉(zhuǎn)基因擬南芥品系，確定其在鎘脅迫下的作用。RT-qPCR表明，在轉(zhuǎn)基因系中表達(dá)高，OE2中表達(dá)高，OE8低。之后選OE3、OE7和OE10轉(zhuǎn)基因幼苗進(jìn)行鎘實(shí)驗(yàn)。CdCl2處理WT、VC和三個(gè)轉(zhuǎn)基因系確定鎘耐受性的表型差異，結(jié)果表明，在CdCl2脅迫下，PeCPK21正調(diào)控轉(zhuǎn)基因擬南芥根長、鮮重和膜穩(wěn)定性。

4.根系中細(xì)胞鎘的積累和鎘通量

Cd熒光探針檢測根部細(xì)胞Cd含量。用CdCl2處理后，所有根細(xì)胞熒光顯著增加，轉(zhuǎn)基因擬南芥熒光強(qiáng)度相對較低，對照組幾乎無熒光，這表明PeCPK21抑制Cd在擬南芥根積累。NMT監(jiān)測擬南芥幼苗根尖中Cd通量，對照組中根頂端區(qū)域通量低，幼苗中Cd通量高，而轉(zhuǎn)基因系OE3、OE7和OE10的Cd2+通量顯著降低。

5.H2O2積累和抗氧化酶活性

Cd積累促進(jìn)植物細(xì)胞產(chǎn)生ROS。用熒光探針H2DCF-DA測定根部細(xì)胞H2O2濃度。CdCl2處理后，所有擬南芥熒光強(qiáng)度均顯著增加，轉(zhuǎn)基因系中Cd誘導(dǎo)的H2O2增加降低，對照組DCF熒光非常低。檢測CAT、APX、POD和SOD的總活性，確定PeCPK21過表達(dá)植株在鎘脅迫下不產(chǎn)生ROS。CdCl2脅迫下所有品系的APX、POD和CAT活性增加，OE3、OE7和OE10活性最高。但CdCl2抑制SOD的活性，WT、VC和PeCPK21過表達(dá)的品系中沒有顯著差異。

6.擬南芥中PeCPK21相互作用的蛋白

為探究PeCPK21介導(dǎo)Cd和ROS穩(wěn)態(tài)的功能，用HaloTag pull-down技術(shù)富集與PeCPK21相互作用蛋白。該實(shí)驗(yàn)過程是使用體外真核蛋白表達(dá)系統(tǒng)將PeCPK21表達(dá)出來，再與胡楊的總蛋白進(jìn)行Pull down實(shí)驗(yàn)，最后將與PeCPK21結(jié)合的蛋白進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。

與PeCPK21相互作用的HaloTag pull-down富集蛋白列中，分為四組：

（I）陽離子/重金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、膜聯(lián)蛋白、K+–H+交換樣蛋白（KHEP）、鈣單向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、銅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白5（COPT5）、寡肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白3（OPT3）、植物防御素樣蛋白2.2（PDF2.2）、PM相關(guān)陽離子結(jié)合蛋白（PCAP1）和ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白I家族成員6（ABCI6）;

（II）質(zhì)子泵亞基、V型質(zhì)子ATP酶亞基a3（VHAa3）、VHA-B1、VHA-C、焦磷酸鹽活化膜質(zhì)子泵2（AVPL1）和V型質(zhì)子ATP酶蛋白脂質(zhì)亞基（AVA-P2）;

（III）抗氧化酶，類囊體抗壞血酸過氧化物酶（TAPX），超氧化物歧化酶（MSD1），抗壞血酸過氧化物酶1（APX1），APX2，APX3，硫氧還蛋白M4（TRXM4），9-順式環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶（NCED1），GPX3，硫氧還蛋白樣蛋白CDSP32和硫氧還蛋白超家族蛋白（PRXQ）;

（IV）膜內(nèi)源蛋白、質(zhì)膜內(nèi)源蛋白1;1（PIP1-1）、PIP2-6、PIP2-7、PIP2A和tonoplast內(nèi)源蛋白。

7.PeCPK21相互作用蛋白的轉(zhuǎn)錄本分析

7.1陽離子/重金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的轉(zhuǎn)錄

通過鈣滲透通道介導(dǎo)Cd進(jìn)入的膜聯(lián)蛋白的轉(zhuǎn)錄被CdCl2上調(diào)，在PeCPK21-OE3、7、10中低于WT和VC。CdCl2增加擬南芥中鈣單向轉(zhuǎn)運(yùn)體、KHEP、COPT5、OPT3和PDF2.2的表達(dá)，但在PeCPK21過表達(dá)系中觀察到更高的水平。然而，用CdCl2處理所有樣品中PCAP1和ABCI6的轉(zhuǎn)錄并未顯著改變。

7.2質(zhì)子泵亞基的轉(zhuǎn)錄

CdCl2處理增加了所有測試品系中VHA-B1、VHA-C、AVPL1和AVA-P2的表達(dá)。與WT和VC相比，VHAB1、VHA-C和AVA-P2的Cd誘導(dǎo)在PeCPK21過表達(dá)的品系中更為明顯。然而，在所有測試品系中，VHA-a3的轉(zhuǎn)錄均未改變。

7.3抗氧化酶的轉(zhuǎn)錄

所有測試品系證明CdCl2上調(diào)PeCPK21相互作用的幾種抗氧化酶的表達(dá)。與WT和VC相比，這些抗氧化酶TAPX、APX1、APX2、TRXM4、NCED1、GPX3、CDSP32、PRXQ在PeCPK21-OE3、7、10中表達(dá)量高。

7.4膜內(nèi)源蛋白的轉(zhuǎn)錄

CdCl2脅迫后，PIP1-1、PIP2A和PIP2-7的轉(zhuǎn)錄水平增加，與WT和VC相比，PeCPK21過表達(dá)植物的水平更高。CdCl2處理不影響PIP2-6和TIP1的轉(zhuǎn)錄。

小結(jié)：

綜上所述，Cd通過激活PeCPK21啟動子上調(diào)胡楊PeCPK21的轉(zhuǎn)錄。鈣傳感器PeCPK21可以提高植物對Cd脅迫的耐受能力，表現(xiàn)為過表達(dá)PeCPK21的擬南芥的根和全株生長減少較少。HaloTag pull-down富集蛋白和相應(yīng)的表達(dá)譜表明，PeCPK21通過與多種重金屬脅迫相關(guān)蛋白相互作用，限制Cd積累，增加ROS清除，改善轉(zhuǎn)基因擬南芥的水分狀況，從而提高Cd耐受性。

HaloTag Pull down技術(shù)簡介

體外蛋白表達(dá)與Pull down技術(shù)相結(jié)合，表達(dá)出目的蛋白和標(biāo)簽蛋白（Halo，GST，His等）的融合蛋白，不受抗體和物種限制，僅借助標(biāo)簽的親和介質(zhì)將目標(biāo)蛋白純化出來，使用Pull down技術(shù)，將目標(biāo)蛋白與互作的蛋白“下拉"，進(jìn)而利用Western Blot或者質(zhì)譜鑒定互作蛋白。蛋白Pull down實(shí)驗(yàn)還可以同時(shí)表達(dá)兩個(gè)蛋白，進(jìn)行點(diǎn)對點(diǎn)的互作驗(yàn)證，也可以僅表達(dá)蛋白質(zhì)的結(jié)合區(qū)域，確定兩個(gè)蛋白結(jié)合的結(jié)構(gòu)域。

本公司能夠提供Halo，GST或FLAG等多種標(biāo)簽的Pull down技術(shù)服務(wù)。

Halo/FLAG-tag pull down是使用基于真核的體外表達(dá)系統(tǒng)來表達(dá)目的蛋白，目的蛋白攜帶Halo/FLAG標(biāo)簽；GST-tag pull down是使用基于原核的體外蛋白表達(dá)系統(tǒng)，或者大腸桿菌誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白，目的蛋白攜帶GST或His標(biāo)簽。

Halo/FLAG-tag pull down技術(shù)優(yōu)勢：

真核表達(dá)系統(tǒng)，蛋白更接近體內(nèi)結(jié)構(gòu)

沒有細(xì)胞內(nèi)干擾因素的限制，表達(dá)成功率高

蛋白表達(dá)載體構(gòu)建成功后，不需要轉(zhuǎn)化和鑒定，可直接表達(dá)目的蛋白，節(jié)省時(shí)間